Вирусологични методи на изследване

Диети

Вирусологичните методи на изследване се използват широко в медицината за диагностициране на различни инфекциозни и определени онкологични заболявания с вирусна природа.

Вирусологични изследователски методи се използват и за идентифициране на вируса, изучаване тяхната биология и способност да се отрази на животното и човешки клетки, което допълнително помага да се разбере патогенезата на вирусни заболявания и да изберете правилните методи за тяхното лечение. В допълнение към установяването на етиологията на болестта и мониторинга на ефективността на терапията, вирусологичните методи за изследване са от голямо значение при определянето и провеждането на противоепидемични мерки.

Директни методи за изследване във вирусологията

Директните вирусологични методи за изследване могат да открият директно в клиничния материал вирус, вирусна нуклеинова киселина или вирусен антиген и по този начин са най-бързи (експресни методи - до 24 часа). Тези методи са по-малко информативни и изискват лабораторно потвърждение чрез индиректни диагностични методи във връзка с честото получаване на фалшиви отрицателни или фалшиви положителни резултати. Следните методи на разследване са директни:

  • оцветяване електронна микроскопия на вируси с отрицателна разлика (за определяне на наличието на вируса и неговата концентрация в материала, при условие, че 1 мл съдържа не по-малко от 105 вирусни частици);
  • Имунна електронна микроскопия, базирана на взаимодействието на специфични антитела с вируси, за да се образуват комплекси, които се откриват по-лесно с отрицателен контраст, отколкото само вирусите;
  • ензимно свързан имуносорбентен анализ (ELISA), като се използват ензимно-маркирани антитела, които се свързват с антигени, образуващи комплекси, идентифицирани чрез добавяне на субстрат за използвания ензим;
  • имунофлуоресцентната реакция (RIF) - пряка или непряка - се основава на използването на антитела, свързани с флуоресцентно багрило;
  • радиоимуноанализ (RIA) се основава на използването на радиомаркирани антитела и гама-броячи;
  • цитологичните методи се основават на микроскопично изследване на оцветени петна, биопсични образци, материали за аутопсия;
  • молекулярни методи - молекулна хибридизация на нуклеинови киселини и полимеразна верижна реакция (първият се основава на откриването на допълващите нишки на нуклеиновите киселини с марката, а втората - на вирус-специфични последователности на ДНК репликацията в основата на три етапа).

Съществуват три варианта за молекулна хибридизация на нуклеиновите киселини - точка хибридизация Southern блот хибридизация (използван за диагноза на HIV инфекция) и хибридизация на място (директно в инфектираните клетки). PCR (полимеразна верижна реакция) се използва все повече при мониторинга и диагностиката на вирусни инфекции поради високата чувствителност и специфичност на този метод.

Непреки вирусологични методи на изследване

Тези методи се основават на идентификацията и идентификацията на вируса. Това са по-времеемки и продължителни техники, обаче, по-точни. Материалът за тези проучвания може да бъде съдържанието на везикули, останки (варицела, херпесни лезии на кожата и лигавиците), назофарингеален измиване (респираторни инфекции), кръв и цереброспинална течност (за арбовирус инфекции), изпражнения (за Ентеровирус инфекции) измивните (с морбили, рубеола и др.). Поради факта, че вирусите могат да възпроизвеждат само в живите клетки, култивиране на вируса се извършва в тъканна култура, пилешки ембриони или в тялото на животното (хамстери, бели мишки, кучета, котки, някои видове маймуни). Индикация на вирус извършва чрез цитопатичен ефект, в gemadsorbtsii отговор на цвят проба, резултатите от инхибиране на хемаглутинацията, на промените или липсата на такава в кокоши ембриони или тъканни култури, чувствителни оцеляване животни.

Серологични диагностични методи, използвани във вирусологията

Серологичната диагноза означава вирусологични изследвания, базирани на реакцията антиген-антитела. Най-често се използват сдвоени кръвни серуми, които се приемат на интервали от няколко седмици. Когато титърът на антителата се увеличи 4 пъти или повече, реакцията се счита за положителна. За да се определи вида на вирусите, реакцията на неутрализиране на вируса се използва, за да се определи груповата специфичност, реакцията на фиксиране на комплемента. Също така често се използва пасивна реакция хемаглутинацията, инхибиране хемаглутинацията, обърната пасивна хемаглутинация, RIF и различни изпълнения имуноанализ.

Съвсем наскоро, в хода на изследванията на генното инженерство е разработена техника за получаване на моноклонални антитела. Тесната специфичност на моноклона е преодоляна чрез използването на няколко моноклонални антитела към различни вирусни детерминанти. Това повиши чувствителността и специфичността на методите за вирусологично изследване с дефиницията на вирусни антигени. Понастоящем са създадени много различни тестови системи за имунологична диагностика на вирусни инфекции.

Методи за изучаване на вируси.

Исторически вирусология откъснала от микробиология, а дори и микробиологична техника не може да се използва при работа с вируси, такива общи принципи като асептична техника, за да се получи изчистени линии, методи на титруване, и най-накрая, ваксинация, е в основата на нова наука. Допълнителното проучване на най-важните свойства на вирусите изисква разработването на редица специални методи. По този начин, способността на вирусите да преминават през бактериални филтри се използва за определяне размера им и чисти, малкия размер на вируси стимулира създаването на по-сложни техники микроскопия. Техническа арсенал от Virology постепенно обогатен методите на физиката, химията, генетика, цитология, молекулярна биология и имунология.

Измерени и претеглени вируси, техният химичен състав, модели на възпроизводство, място в природата, роля в произхода на болестите и разработване на ефективни методи за борба с вирусни инфекции. Вирусите се отглеждат със специални методи, чрез заразяване на лабораторни животни, пилешки ембриони и тъканна култура. В зората на вирусологията бяха проведени изследвания върху лабораторни животни (бели мишки, морски свинчета, зайци). Те въведоха "подозрителен материал" и съдейки по модела на болестта, какво е причинил вирусът. За възпроизводството и изолирането на вируси, в допълнение към лабораторните животни, започнаха да се развиват пилешки ембриони, при които някои вируси се размножават добре, акумулирайки, понякога до значителни количества.

От началото на 50-те години на миналия век е разработен метод за тъканна култура: клетките от живата тъкан се отделят чрез ензими, прехвърлят се в специална стерилна чиния, добавя се комплексна хранителна среда и се поставя в термостат за растеж. Клетките започват да се разделят и постепенно покриват повърхността на стъклото с равномерно непрекъснат слой. Ако такива клетки са заразени с вирус, тогава техният разрушителен ефект може да бъде наблюдаван директно. Методът на тъканната култура позволява да се откриват нови вируси и да се изследва взаимодействието на вирусите и клетките.

Изолирането, размножаването и идентифицирането на видовете вируси са основните методи за практическа вирусология. Тази работа обикновено се състои от две основни части: изследване на клетки, заразени с вируса, и изследване на изолирани вируси.

За откриване на инфектирани клетки се използват различни методи за вирусологична диагностика: методът на флуоресцентните антитела, които правят възможно ясно идентифициране на наличието на вируси в клетки, които изглеждат външно незаразени; метод за записване на скоростта и естеството на вирусното мултиплициране на базата на унищожаването на (пълни или частични) клетки. Важна роля при диагностицирането на вирусни инфекции е определянето на титри на специфични антитела в серума на пациентите с помощта на различни имунологични реакции - неутрализация, фиксиране на комплемента, забавяне на хемаглутинацията и т.н.

ΙΙ. Характеристики на структурата и възпроизвеждането на вируси

От дълго време съществуването на вируси се оценява от патогенните им ефекти. Директното виждане на вирусите е възможно само след изобретяването на електронен микроскоп, което води до увеличение на десетки и стотици хиляди пъти. Това се случи около 50 години след откриването на вируси.

Най-големите вируси се доближават до размера на малките бактерии, най-малките - до големи протеинови молекули, например, до молекулата на хемоглобина в кръвта. С други думи, сред вирусите има гиганти и джуджета. За измерване на вируси се използва условна стойност, наречена нанометър (nm). Един нанометър е милион от милиметър. Размерите на различните вируси варират от 20 до няколкостотин нанометра. За сравнение, ние ще дадем стойността на най-малките кръвни клетки - еритроцити, равна на 7000-8000 nm, т.е. вирусите са по-малко от червените кръвни клетки в десетки и стотици пъти. Чрез появата на тялото на вируси приличат на кубчета, пръчки, топки, полихедра и нишки.

Простите вируси се състоят от протеини и нуклеинова киселина. Най-важната част от вирусната частица е нуклеиновата киселина - това е носител на генетична информация. Ако човешки клетки, животни, растения и бактерии, винаги съдържат два вида нуклеинови киселини - дезоксирибонуклеинова - ДНК и рибонуклеинова - РНК от различни вируси открити само един тип - или ДНК или РНК, която е в основата на тяхната класификация. Вторият задължителен компонент на вириона е, че протеините се различават при различните вируси, което им позволява да бъдат разпознати чрез имунологични реакции.

По-сложните вируси, в допълнение към протеините и нуклеиновите киселини, съдържат въглехидрати, липиди. Всяка група вируси има собствен набор от протеини, мазнини, въглехидрати и нуклеинови киселини. Някои вируси съдържат ензими.

Всеки компонент на вириона има специфични функции: белтъчна обвивка предпазва от странични ефекти, нуклеиновата киселина е отговорен за наследствени и инфекциозни свойства и има водеща роля в променливостта на вируса, и ензими, участващи в тяхното размножаване. Обикновено нуклеиновата киселина се намира в центъра на вириона и е заобиколена от протеиново покритие, сякаш е облечено в него. На капсида се състои от определен начин подобни подредени протеинови молекули, които образуват симетрична геометрична форма, заедно с нуклеиновата киселина на вируси. В случай на кубична симетрия нуклеокапсид нишка нуклеинова киселина се разточва на топка и капсомери са плътно опаковани около него. Така разположени полио вируси, шап, аденовирус, реовируси, риновируси и др. С спирала (пръчковидни) симетрия вирус нуклеокапсид нишка нуклеинова киселина е усукан в спирала, всеки ред от неговите обхванати капсомери в непосредствена близост един до друг. Структурата на капсомерите и появата на вирионите могат да се наблюдават чрез електронна микроскопия.

Фигура 3. - Диаграма на структурата на човешкия имунодефицитен вирус (1 - капсомери, 2 - геном, 3 - липопротеинова обвивка (супер капсид), 4 - гликопротид)

При комплексно подредени вируси ядрото, под формата на плътно сгъната спирала, е покрито с една или повече външни обвивки, които съдържат различни вещества. Такава структура има например вируси на едра шарка, грип и параинфлуенца. Структурата на вирусните бактерии - бактериофаги (фаги), които се състоят от главата и опашката, са изследвани подробно. Опашката на фага е облечена с протеиново покритие, от което излизат дълги тънки влакна, играейки ролята на смукатели, когато фаговата частица е прикрепена към бактерията.

Дата на изпращане: 2016-06-22; гледания: 1281; Поръчайте запис на работа

Методи за изследване на вируси

ВИРУСОЛОГИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ - проучвания, проведени с цел диагностициране на вирусни инфекции, изследване на съответните патогени, тяхното разпространение в природата, както и при производството на вирусни препарати. Във вирусологичните лаборатории вижте меда. Профил изучава като човешки вируси, така че в някои случаи, животински вируси (напр., Да извършват диагностика на бяс при кучета, животни изпит, който се използва за производството на вирусни препарати). Методите за изследване на двата са подобни.

Един от основните етапи на V. и. е изолирането на вируси. С изолирането на вируси от хора се използва кръв, различни тайни и екскременти, парчета от органи. Най-често кръвта се изследва при заболявания на арбовируса. Използва се цяла дефибринирана или хемолизирана кръв, някои от нейните елементи или съсиреци (в късните стадии на заболяването). Вируси на бяс, епидемия, паротит, херпес симплекс се намират в слюнката. Назофарингеални натривки се използват за изолиране на патогени грип, морбили, пситакоза, риновирус, респираторен синцитиален вирус, аденовирус. При промивки от конюнктивата се откриват и аденовируси. Промиването се извършва чрез изплакване на носа и фаринкса (поотделно) и измиване на конюнктивата с изотоничен разтвор на натриев хлорид. Можете да избършете носните проходи и задната стена на фаринкса с тампони, напоени с бульон. Нестерилният материал се третира с антибиотици (1000 единици пеницилин и стрептомицин на ml) в продължение на 30 минути. От изпражненията се изолират различни ентеровируси, адено-и реовируси. Пробите се разреждат с 1:10 с фосфатен буфер, центрофугират се два пъти в продължение на 20 минути. при 8000 об / мин. Добавят се антибиотици, както е посочено по-горе. По-рядко за V. и др. вземете съдържанието на пустули (с едра шарка, варицела, херпес) и точкови органи (с венерически лимфогранулом). Секвенционният материал трябва да се вземе възможно най-скоро след смъртта на тялото. Съхранява се до времето на изследването при t ° -20 ° и по-ниско. За да извършите V. и. тъканта се раздробява (смила се) и 10-20% суспензия се приготвя върху изотоничен разтвор на натриев хлорид или хранителна среда за клетъчни култури. Той се центрофугира в продължение на 20 минути. при 1500 rpm; Супернатантът се използва за по-нататъшно изследване.

За да се изолират вируси, са инфектирани лабораторни животни, птичи ембриони, клетъчни и тъканни култури. Животните са подходящи, ако вирусът ги кара да имат ясни клинични симптоми на заболяването или патоанатомични промени (напр. Парализа, пневмония и др.). От тропизма на вируса зависи ефективността на един или друг начин за въвеждане на материала. Широко използвана инфекция под кожата, интраперитонеално и интравенозно. Невротропно вируси, открити от инфекция на животните в церебрална хемисфера (арбовируса, вирус на бяс, и т.н.), таламуса (полиовирус в експериментите на маймуни), гръбначния мозък. Вируси на едра шарка и херпес могат да бъдат открити чрез прилагане на материал за зайци на скаризирана роговица. Някои вируси могат лесно да бъдат открити чрез инокулация в предната камера на окото (например вируса на хепатит на кучетата в експеримента на кученцата). За изследването на респираторни инфекции агенти, използвани обикновено интраназално заразени животни (вливане в анестезирани животното носа материал или прилагане под формата на аерозол в специална камера). В храносмилателния тракт материалът се инжектира с храна или през устата с тъп игла. При изучаване на някои онкогенни вируси се използва методът за инфектиране на златни хамстери в лигавицата на бузите.

За много вируси новородените животни и сучетата са по-податливи на сексуално зрели индивиди. Смучещите мишки се използват широко за изолиране на вирусите на арбовирусите и Coxsackie (след инфектиране в мозъка). Някои аденовируси могат да индуцират тумори с подкожна инфекция на новородени златни хамстери. Проучване на редица птичи вируси се извършва върху пилетата от първите дни от живота.

Използването на пилешки ембриони има няколко предимства. Техните недиференцирани тъкани имат широк обхват на чувствителност към много вируси. Наличието на инфекция се оценява от смъртта на ембриона, промени външния вид (хлътва) на Chorio-алантоична мембрана (фиг. 1), натрупване на течности в ембрионален хемаглутинин и комплемент-свързващи вирусен антиген. Ембрионите инокулират върху хориоалантоинова мембрана (на възраст 11 - 12 дни шарка вирус група) в Аланто и амниотичната кухини (10-11 ден miksovirusami), жълтък торбичка (на възраст 5-6 дни патогени psittakozaornitoza и др.). Инокулацията на материал в ембрионите в мозъка и интравенозно (в съдовете на мембраните) рядко се прави. При всеки метод на заразяване ембрионите могат да бъдат травматизирани, така че тези, които са били убити през първите 24-48 часа. изключени от счетоводството.

За да проучи ефекта върху вирусите на chem. веществата са много удобни де-ембрионизирани яйца, в които е отстранен ембрионът, но се запазва хориоалантоичната мембрана. Вътре поставете вируса и веществото в 20 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид. Отворът в корпуса е затворен с капачка с тръба, през която можете да вземете проби за анализ.

При оценката на експериментите върху животни и ембриони на птици, трябва да се има предвид възможността за предизвикване на латентни инфекции или изолиране на латентен вирус.

Обширно за изолиране и натрупване на вируси се използват клетъчни и тъканни култури (вж. Тези методи могат да се използват за култивиране на повечето известни вируси (виж Култивиране на вируси). Някои от тях се натрупват интензивно още по време на първичната инфекция на културите, други изискват няколко пасажа. Възпроизвеждането на повечето вируси в клетъчните култури е придружено от развитие на цитопатичен ефект. По своята същност до известна степен може да се съди за вируси, принадлежащи към конкретен раса: пикорнавируси причиняват закръгляне и клетъчно свиване, аденовирус - образуването на клъстери от заоблени клетки под формата на грозд, miksovirusy и херпесни вируси - образуването на многоядрени синцитий. Редица вируси не могат да се култивират извън тялото.

Възпроизвеждането на някои вируси (вариола група mikso- и арбовируса) могат да бъдат открити чрез реакция gemadsorbtsii защото засегнатите клетки придобиват способността да адсорбира червени кръвни клетки. Съответните еритроцити (човек, маймуна, морско свинче, пиле) в концентрация от 0.4-0.5% се поставят върху монослой при t ° 4 ° или при стайна температура в продължение на 20-30 минути. Еритроцитите се адсорбират дифузно през цялата култура (например параинфлуенца вируси) или формират островчета (грипни вируси, паротит).

Размножаването на вируса понякога се преценява чрез изследване на течността на културата върху животни (енцефалит, причинен от кърлежи) или в DSC. Наличието на вирус, който няма цитопатична активност, понякога се определя от способността му да взаимодейства с цитопатогенния вирус. Така, в култури от клетки на пилешки ембриони, инфектирани с вируси на птичи левкемия, се възпрепятства възпроизводството на вируса на саркома на Raus. За откриване на вируси netsitopatogennyh щамове на диария по говедата и свиня холера предложен метод END (издигане на вируса на нюкасълската болест) - суперинфекция култури вируса на нюкасълската болест. С комбинираното действие на двата вируса се получава разрушаване на клетките.

Когато се появят цитопатични промени или други признаци на вирусно размножаване, културната течност се използва за идентифициране на вируса или преминаването. Редица вируси остават свързани с клетките, дори в случай на дегенерация на културите (аденовируси, вируси на едра шарка), като по този начин се замразяват и размразяват култури преди събирането на течности. Някои херпесни вируси, например вирусът на болестта на Marek при пилетата, трябва да бъдат трансплантирани заедно с непроменени клетки.

За да се изследват човешки респираторни коронави вируси и някои други, се използва методът на тъканна култура, т.е. инфекция на култивирани in vitro тъканни фрагменти. Най-често използваната тъкан е трахеята на заек. Умножаващият вирус засяга ендотелните клетки на лигавицата, което се определя от спирането на движението на ресничките.

Трябва да се има предвид възможността от външни вируси в култури от тъкани и клетки. Те могат да бъдат въведени с клетки, ако последните са взети от заразен организъм, от трипсин или серум, използвани за култивиране на клетки.

В допълнение към засяването или разрез биопсия материал вече отглежда културата прилага директно култивиране на клетките изследвани органи след трипсинизиране, често по-ефективно срещу изолиране на вируса (напр., За откриване на аденовирус в сливиците). Използват се също са смесени култури на процедурата, когато клетките тест тялото растат заедно с всеки вирус, чувствителен към дадените клетки (напр., засяване клетки в мозъка на пациенти с субакутен склерозиращ паненцефалит с маймунски бъбречни клетки или Hela-клетки за изолиране на вирус на морбили). Метод на смесени култури често е единственият начин за изолиране на вируса от тях индуцирани тумори при животни, които не произвеждат активен вирус, обаче, съдържа вирусния геном.

Еднослойните клетъчни култури дават възможност да се получат колонии от вирусните плаки (Фигура 2). По правило плаките образуват вируси, които имат цитопатична активност. В същото време, този метод може да открие някои netsitopatogennye вируси (напр., Редица щамове на диария при говеда). За получаване на плаки вирусът се прилага върху клетъчния монослой в чаши или плоски бутилки. Множеството инфекция, т.е. броят на вирусните частици на клетка, трябва да бъде малка, така че образуваните плаки да не се сливат. След 30-60 минути. слоеста адсорбция среда с 1,35 - 1,5% агар, и неутрално червено при крайно разреждане от 1: 000 култура в 40 петриеви блюда се инкубират в атмосфера с 5-10% въглероден диоксид, и херметично запечатани флакони - в конвенционална пещ. След няколко дни, между клетките, оцветени за цял живот, започват да се появяват небоядисани огнища на дегенерирали клетки.

Можете да поставите агар без неутрално червено върху клетките и след няколко дни да приложите втори слой агар с боята; плаките стават видими след няколко часа. Агарът понякога съдържа сулфати на полизахариди, които са инхибитори на вирусния растеж; За неутрализирането им, към средата се прибавя протамин сулфат (60 mg на 100 ml). За да се получат плаки от редица вируси, като покрития могат да се използват метилцелулоза и други вещества. Някои вируси (едра шарка, морбили) образуват плаки и без покритие с агар. Методът на плаката позволява клонален анализ на вирусни щамове. За да се изолират генетично хомогенни клонове, се отделя една плака, която се използва за следващата инфекция. Обикновено клонирането се извършва за три пасажа.

Методът на плаките е също подходящ за определяне в заразената култура на броя на клетките, продуциращи вируса (т.е. броя на инфекциозните центрове). За тази цел клетките се суспендират, поставят се върху еднослойна култура на чувствителни към вирус индикаторни клетки и се пълнят с агар. Около заразените клетки се образуват плаки.

За диагностицирането на вирусни инфекции и изследването на антигенната структура на вирусите се използва реакцията на утаяване в гела. Най-често агарът се използва за тази цел. Антигените и специфичните антитела, поставени в агарния гел на известно дифузно разстояние, образуват утайка под формата на бели ивици. 0.8-1% агар в изотоничен разтвор на натриев хлорид или фосфатен буфер се поставя в капиляри или се нанася върху слоеве. За предпочитане антигените се пречистват и концентрират. Съставките на реакцията се прилагат към агара към противоположните краища на капиляра или към ямките, направени в агарния слой върху стъклото на разстояние от 5 до 6 mm. Инкубацията продължава 4-20 часа.

Значителен брой V. и. се извършват чрез светлинна и електронна микроскопия. Най-големите вируси (напр. Едра шарка) след подходящо третиране (сребърен, оцветяване на Виктория и др.) Могат да бъдат открити с конвенционална светлинна микроскопия. Този метод се използва при диагностицирането на едра шарка чрез изследване на материала от пустули. Характерна за някои инфекции е образуването на топлоклетъчни включвания в клетките. Така че, в ядрата има включения за херпесни и аденовирусни инфекции, в цитоплазмата - с едра шарка (корпус Guarnieri) и бяс (тялото на Babesh-Negri). Откриването на включенията е важно за диагностицирането на бяс, едра шарка, цитомегалия, подостър склерозиращ паненцефалит и други.

Микроскопията в тъмно поле (вижте Microscopy на Darkfield) и микроскопията с фазов контраст (вж. Пр. да проучи динамиката на промените в клетките, заразени с вируса. По-широко използвана луминесцентна микроскопия (вж.).

Проучвания на петна, отпечатъци и еднопластови клетъчни култури, отглеждани на очила. Препаратите (местни или фиксирани) често са оцветени с акридин оранжев. Методът позволява откриването на големи вируси и клъстери на вирусни компоненти. Формите, съдържащи ДНК, с ярко зелена светлина и тези, съдържащи РНК, са тухла-червени. Още по-често, когато V. и др. продуцират лечение на инфектирани клетки с флуоресцентни антитела, което позволява откриването на клъстери на вирусен антиген. При директния метод се използва имунен гама глобулин, белязан с флуоресцентно багрило, например флуоресцеин-изотиоцианат. С непрекия метод препаратът се третира с обичайния имунен серум на животно и след това с белязани антитела срещу гама глобулина на това животно. Препаратите се изследват в ултравиолетова светлина, вирусният антиген се открива чрез светло зелена луминисценция (виж Immunofluorescence). Методът на тампоните от назофаринкса позволява ранна диагностика на респираторни вирусни инфекции - грип, параинфлуенца, носорози и аденовируси, респираторен синцитиат.

Електронната микроскопия (виж) позволява да се изследва размерът и структурата на вирусните частици, както и леките промени, причинени от тях в клетките. Представени са вирусна суспензия или ултра-тънки участъци от инфектирани клетки. Някои вируси (напр. Редица човешки и животински онконавируси) могат да бъдат открити в тъканите само с този метод.

B. и., Чиято цел - да се определи количеството (титъра) на вируса или вирусните антитела, са много разнообразни.

Под електронен микроскоп е възможно да се изчисли броят на вирусните частици в суспензия, ако е достатъчно пречистен. Вирусът се смесва с полистирен латекс, броят на известните частици. Сместа се разпръсква върху решетка, броят на частиците в отделните капки се преброява. Съотношението на броя на латексните частици и вирусите разкрива броя на вирионите в даден обем. Този метод не дава представа за инфекциозната активност на вируса, тъй като вирусната суспензия обикновено съдържа значителен брой неинфекциозни частици.

Най-точният начин за определяне на броя на инфекциозните единици в материала позволява метода на плаките. Еднопластовите клетъчни култури се заразяват с малка доза от вируса. Титърът се изразява чрез броя на единиците, образуващи плаки (PFU) в 1 ml. По същия начин, може да се определи на вирусния титър на някои онкогенна трансформация на жилища, както и тези средства, които образуват pockmarks на хориоалантоинова мембрана на пилешки ембриони (напр., Вариола вируса).

По-малко точно е определянето на вирусния титър чрез метода на крайни разреждания. Постоянно увеличаващи се разреждания (обикновено десетократно) се прилагат на чувствително животно, в пилешки ембриони или клетъчни култури. Като се вземе предвид резултатът от всяко приложение като положително или отрицателно, определяне на най-ниската доза на вируса, който може да предизвика определен ефект (болест или смърт на животното, появата на цитопатични промени в култура и т. П.). На практика тази доза е трудна за определяне, така че изчислете дозата, даваща 50% ефект (ED50). Тя се определя в зависимост от свойствата на вируса и метода на титриране на броя на умрелите животни (LD50), броят на делата (ID50), Броят на ембриони в които има вирусен хемаглутинин или допълват антигени, в зависимост от броя на клетъчни култури, при което бяха идентифицирани цитопатни промени или haemadsorbing активност. Титърът се изразява чрез ED50 число в определен обем материал.

От съществуващите методи за изчисляване на ED50, най-често се използва методът на Reed-Munch, основан на принципа на кумулация. Тя се основава на предположението, че всеки тестов обект (мишка, ембрион), който реагира положително на въвеждането на това разреждане, ще реагира с положителна реакция към въвеждането на по-концентриран вирус. И напротив, ако това разреждане предизвика негативна реакция, тогава с въвеждането на по-голямо разреждане ще има и отрицателна реакция. Интервалите между разрежданията по този метод трябва да бъдат еднакви, като всяко отглеждане инфектира не по-малко от 4 животни (култури). Допълнителна интерполация между дозите, която е причинила ефекта най-близо до 50%. Изчислението се извършва по формулата:

където В - най-ниската доза, която причинява ефект повече от 50%, б - Ефектът на дозата в проценти, и - най-високата доза ефект, причинено от ефект на по-малко от 50%, в проценти, г - интервал между логаритми на две съседни дози.

Вирусите с изразена цитопатична активност (напр. Вирус на полиомиелит) могат да бъдат титрувани чрез метода за тестване на цветовете. Той се основава на факта, че по време на растежа на клетките рН на средата се понижава, а в заразените култури, където клетките се дегенерират, няма промяна в рН на средата. За откриване на тези промени се добавя фенолен червен индикатор към средата с рН повече от 7 червени, при рН 7 оранжево и при рН под 7, жълто. На хранителна среда с рН 7,3-7,4, като фенол червено при крайна концентрация от 1: 40 000. минималната доза на клетките, средата промяна на цвета от червено до жълто (обикновено около 25 000 на 0.25 мл). След това се приготвят 10-кратно разреждания на вируса, всеки от които се излива в 4-6 епруветки, към които се прибавя клетъчна суспензия. Тръбите са затворени с гумени запушалки или се изсипват 0,6-0,8 ml вазелиново масло. Резултатите се вземат предвид след стареене в продължение на 5-7 дни при t ° 37 °. За вирусния титър се взема разреждането му, като се предотвратява пренасочването на рН към киселинната страна в 50% от епруветките.

Способността на имунните серуми да неутрализират инфекциозната активност на вирусите се определя от реакцията на неутрализация. Методите за титриране на серумите са предварително определени чрез методи за титриране на съответните вируси. Всички те се основават на приготвянето на смеси от вируса със серум, които след това се тестват за наличието на ненутриран вирус. Реакцията е в две версии. В една от тези имунни и нормален серум в разреждане (например, 1:. 10) се смесва с увеличаване на 10-кратни разреждания на вируса в равен обем и се определя вирусния титър в присъствието или на серум. Коефициентът на ЕД50 вирус в присъствието на нормален серум върху неговата ED50 в присъствието на имунната ще бъде индекс на неутрализация на това разреждане на имунния серум. Този резултат не може да бъде интерполиран до други серумни разреждания (например активността на неразреден серум ще бъде по-висока от изчислената). Алтернативно, постоянна доза от вируса (обикновено около 100 ED50) се комбинира със серия от двукратно разреждане на тествания серум. Титърът на серума ще бъде разреден, като вирусът тип to-ry причини 50% ефект.

В зависимост от метода на титруване на вируса неутрализиране на реакцията се извършва на лабораторни животни пилешки ембриони (от тяхната хемаглутинини загуба или натрупване), в клетъчни култури (за появата на цитопатичен промени цвят проба и г. Н.). Ако вирусът се образува на хорьолантановата мембрана на пилешки ембриони, се определя най-голямото серумно разреждане, което намалява броя на костите с 50 или повече процента. По подобен начин, серумът се титрува в зависимост от намаляването на броя на вирусните плаки върху еднослойни клетъчни култури.

Вирусното титруване RGA и HAI антитела се основава на способността на някои вируси (miksovirusy, някои представители на поксвирусите, аденовируси, пикорнавируси и Togaviridae) червените кръвни клетки да се придържат заедно. Вирусът се титрува в двойни разреждания с равен обем от 0,5-1% от суспензията на еритроцитите. За титъра (1 АЕ - аглутинираща единица), вземете най-голямото разреждане, което причинява хемаглутинацията (вж. Хемаглутиниращи вирусен титър е мярка за неговото инфекциозна активност като хемаглутинацията) може да доведе до не-заразни "непълни" частици, инактивиран вирус и да се отделят от някои вирус хемаглутиниращ антиген. Серуми в RTGA, титрувани в двойни разреждания с 2-4 вируса на АЕ; титър се счита за най-високо разреждане, което напълно подтиска хемаглутинацията).

Някои вируси се адсорбират върху еритроцитите, но не предизвикват аглутиниране. За да ги откриете, можете да използвате непряката реакция на хемаглутинация. Тя се основава на аглутинацията на "специфичен за еритроцитите" вирус-специфичен серум по отношение на този вирус. Този метод се използва главно за титруване в серума.

Реакцията за фиксиране на комплемента (виж) е подходяща за титруване на двата вируса (по-точно комплекси-свързващи вирусни антигени) и антитела. По принцип RSK с вируси не се различава от тази с бактериални и други антигени. Разлики съществуват само при метода за получаване на антигени. Както вирусни антигени могат да бъдат кръв, назофарингеални промивки, урина, изпражнения на пациенти, заразени суспензия органи, части от ембриони инфектирани пилета и отглеждани в клетъчни култури от вирус. Най-подходящи са културните антигени. Суспензии заразени органи преди употреба многократно замразени и размразени, комбиниран с равен обем етер или хлороформ, завихрят в продължение на 1-2 часа, след това се оставя да стои 18-20 часа. при t ° 4 °, отново се замразява, размразява и се избистря чрез центрофугиране. За да се получат серуми, животните не трябва да се имунизират с вирус, който се култивира в същия субстрат като антигена за реакцията. В зависимост от титруване цели, свързани с двукратни разреждания на антиген специфичен серум доза или, алтернативно, двукратни разреждания на серума с една доза от антиген. Контактът на антиген, серум и комплемент се провежда в продължение на 1 час при t ° 37 ° или 18 h. при t ° 4-6 °. След добавянето на хема-системата, материалът се инкубира за 30 минути. при t ° 37 °. Резултатите се оценяват съгласно общите правила.

Има техники за титруване на вирусите и антитела на базата на вируса в заразените клетки проявяват флуоресцентно антитяло на културата, както и няколко други, които се използват рядко.

Токсичният ефект, присъщ на определени вируси, се открива чрез прилагане на големи дози на животни по необичаен начин, при които вирусът не претърпява пълен цикъл на репродукция. Например грипният вирус се прилага на мишки в мозъка или интравенозно. За токсичния му ефект се преценява смъртта на животните през първия ден.

Антигенната активност на вируса (или ваксината) се установява чрез имунизиране на хора или животни и след това определяне на титъра на антителата в техния серум. Имуногенната активност на ваксината, т.е. способността да предизвиква резистентност към инфекция, се определя чрез имунизиране на животните, възприемчиви към вируса. След това имунизираните животни и контролните неимунизирани се инфектират с редица разреждания на вируса, определяйки неговата ED50 и за двете групи. Разликата в получените индекси характеризира имуногенността на изпитваното лекарство. Ако вирусът няма патогенност за животните, имуногенността на съответната ваксина може да бъде определена само в епидемиола. опит.

За да се изследват редица свойства на вирусите (размер, структура, химичен състав и т.н.), е необходимо да има пречистен материал с висок титър. Най-често използваният вирус се отглежда в клетъчни култури или под формата на алантоична течност от заразени пилешки ембриони. Почистване обикновено започват с диференциално центрофугиране, първо в 15-20000 г (g- земно ускорение) незалепващ материал от клетъчни остатъци, и най-50-100000 г - утаява чрез самия вирус... За да се освободи от големи частици прилага и филтруване през азбест уплътнение (тип Seitz), стъклени и целулозни мембранни филтри (тип Millipore). Фрагментите, които са по-малки от вируси могат да бъдат отстранени чрез филтрация на материала чрез Sephadex гелове, забавянето в зависимост от размера на порите на определен размер частици. За изолиране и концентрация на вируса от големи обеми на използвания изсолване с амониеви и натриеви сулфати, утаяване с алкохол, алуминиев хидроксид или полиетилен гликол. За да се освободят от баластните протеини, се използва и тяхното разграждане с протеолитични ензими. Мишовирусите могат да бъдат пречистени и концентрирани чрез адсорбция върху еритроцити при ниска температура с елуиране при по-висока температура.

По-нататъшно пречистване и концентрация на вируса се получава чрез този или този метод на фракциониране. Тези методи се използват също така за отделяне на мутантни вируси и отделни вирусни компоненти. При смесване на вируса със система фаза, образувана от водни разтвори на два полимера, тя отива в една от фазите в зависимост от техния размер, йонния състав на средата, рН и т.н. За почистване на големи вируси обикновено се използва декстран система -. Метилцелулоза, малък - декстран-сулфат с полиетиленгликол. Полимерите, които остават след разделяне на фазите, често се отстраняват по време на по-нататъшно пречистване на вируса. Декстран сулфатът може да бъде отстранен чрез добавяне на калиев хлорид, метилцелулоза с амониев сулфат, полиетилен гликол с хлороформ и други методи.

Virus Пречистване чрез колонна хроматография на базата на тяхната способност да се адсорбира върху редица вещества, и се елуира от тях (вж. Хроматография) с промяна на рН или сол концентрация. Използва се за адсорбция на калциев фосфат гелове, йонообменници, базирани на целулоза (обикновено анионни обменители, например, DEAE) йонообменна смола. Елуирането на вируса се извършва с калциев фосфат фосфат буферни разтвори с увеличаваща се концентрация и с йонообменители на базата на целулоза - натриев хлорид.

Високо пречистени суспензии се получават чрез центрофугиране в течна колона с гъстота разпределена в непрекъснат градиент. Вирусните частици се събират на ниво, където плътността на средата е равна на тяхната плаваща плътност. Зоналното центрофугиране в захарозния градиент позволява разделянето на частиците с различни маси. Материалът се прилага върху градиент, създаден чрез наслояване на съответните разтвори на захароза. В края на центрофугирането се събират фракции, които пробиват дъното на тръбата. При равновесно или изопициново центрофугиране вирусните частици се суспендират в разтвор на цезиев хлорид, цезиев сулфат или рубидиев хлорид. След продължително центрофугиране се създава стабилен градиент на непрекъснатата плътност на разтвора. На мястото на вируса частиците могат да определят тяхната плътност. Трябва да се отбележи, че получените стойности на плътността и масата на вирусните частици до известна степен зависят от средата, използвана при центрофугирането.

Когато V. и. Вирусите, означени с различни радиоактивни изотопи, се използват широко. въглерод се използва най-често 14 ° С, тритий, 3Н, фосфор 32Р, сяра 35 S, йод 131 I. лесният белязан вирус при култивирани в клетъчни култури. Радиоактивността се определя при използване на течни сцинтилационни броячи или чрез авторадиография (виж).

Chem. състава на вирусите се изследва чрез конвенционален химичен процес. методи. Нуклеиновата киселина обикновено се получава чрез фенолна екстракция и по-рядко се използват анионни детергенти, додецил или натриев лаурил сулфат.

За да се идентифицират вируси (вж.), Първо е необходимо да се установи техният общ аксесоар. За това е необходимо да се определи размера и структурата на вирусни частици образуват в тях нуклеинова-ви, присъствието на Lipoid черупката. Тип нуклеинова да-често определя от косвени методи, например чрез използване на бромодеоксиуридин способност да инхибира размножаването на ДНК-съдържащи вируси. Наличието на вирус в Lipoid черупката монтиран върху неговата чувствителност към действието на етер и хлороформ (инактивирани вируси с обвивка). Освен идентификацията се осъществява с набор от антисеруми на известните вируси се използват различни реакции -. Неутрализира, DGC, HI и др малко имунизирани животни произвеждат известни вирус с още неизвестен замърсяване или обратно.

Библиография: Лабораторна диагностика на вирусни и рикетсиални заболявания, изд. Е. Ленит и Н. Шмид, с английски., M., 1974, bibliograf.; Luria G. Ye., And Daryl JE, General Virology, trans. с английски., M., 1970, bibliograf.; Методи на вирусологията и молекулярната биология, trans. с английски., М., 1972; Д-р Шенченков-Ш., Семенов БФ иЗезе-р о в Е. Г. / Стандартизация на методите за вирусологично изследване, М., 1974, bibliograf. Ръководство за лабораторна диагностика на вирусни и рикетсиални заболявания, изд. П. Ф. Сендовски и М. М. Соколов, М., 1965; Соколов МИ, Sinitskii AA и Remezov PI Вирусологични и серологични изследвания на вирусни инфекции, Л., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. Г. Старк, Жена, 1968 г., Библиогр.

Методи за изследване на вируси

Отличителни черти на методите за изучаване на вируси. Същността, значимостта и приложението на електронната и имуноелектронна микроскопия, специфичността на метода на имунофлуоресценция. Описание на метода на молекулярната хибридизация. Схема на електронния микроскоп.

Изпращането на добрата ви работа до базата знания е лесно. Използвайте формата по-долу

Студенти, завършили студенти, млади учени, които използват базата от знания в своето обучение и работа, ще ви бъдат много благодарни.

Хоствано на http://www.allbest.ru/

Министерство на образованието и науката на Руската федерация

Федерална държавна бюджетна образователна институция за висше професионално образование

Факултет по природни науки

Катедра по ботаника и генетика

Методи за изследване на вируси

Завършен: Evteeva D.S.

МЕТОДИ ЗА ИЗВЪРШВАНЕ НА ВИРУСИ

ЕЛЕКТРОННА МИКРОСКОПИЯ НА ВИРУСИТЕ

МЕТОД НА МОЛЕКУЛНА ХИБРИДИЗАЦИЯ

СПИСЪК НА ИЗПОЛЗВАНАТА ЛИТЕРАТУРА

Вирусите като задължителни интрацелуларни паразити не могат да растат на изкуствени хранителни среди. Те могат да се възпроизвеждат само в организмите на податливи гостоприемници или в живи клетки, чувствителни към вируса.

Податливи организъм гостоприемник за изучаване на вируси използват в случаите, когато няма експериментални системи за изучаване патогенезата на вирусни инфекции, за тестване на безопасността на вирусни ваксини или специфична вирусна безопасност наркотици. В допълнение към очевидните предимства, методите имат недостатъци и ограничения, свързани с трудностите при стандартизацията и възпроизводимостта на резултатите, както и поради относително високата цена на експериментите.

Клетъчните култури, въведени в изследователската практика през 40-те години, радикално променят методологичния арсенал на вирусологията.

В момента културните методи са фундаментални в експерименталната и практична вирусология.

Изследователските методи, използвани във вирусологията, се различават значително по сложност, което се дължи основно на абсолютния вътреклетъчен паразитизъм на вирусите и техния малък размер.

МЕТОДИ ЗА ИЗВЪРШВАНЕ НА ВИРУСИ

Изследователските методи, използвани във вирусологията, се различават значително по сложност, което се дължи основно на абсолютния вътреклетъчен паразитизъм на вирусите и техния малък размер.

В изследването на материали, получени от пациенти с вирусни инфекции, се използват различни методи за лабораторна диагностика на тези заболявания:

· Методи на електронна и имуноелектронова микроскопия;

· Метод на молекулярната хибридизация;

· Метод на имунофлуоресценция;

· Идентифициране на антитела от клас lgM.

ЕЛЕКТРОННА МИКРОСКОПИЯ

Електронната микроскопия е метод за изучаване на структури, които са извън границите на видимостта на светлинния микроскоп и имат размери по-малки от един микрон (от 1 микрон до 1-5 А).
Действие електронен микроскоп (Pril.1.ris.1) се основава на използването на посоката електронен поток, който служи като лъч светлина в светлинен микроскоп, както и ролята, която играе лещи магнити (магнитно обектив).

Поради факта, че различните части на обекта, които се изследват, задържат електрони по различни начини, на екрана с електронен микроскоп се получава черно-бял образ на изследваната вещ, увеличен на десетки и стотици хиляди пъти. В биологията и медицината се използват предимно електронни микроскопи от полупрозрачен тип.

Електронната микроскопия се появява през 30-те години, когато се получават първите изображения на някои вируси (тютюнев мозаечен вирус и бактериофаги). Понастоящем електронната микроскопия е открила най-широко приложение в цитологията, микробиологията и вирусологията, което води до създаването на нови клонове на науката. С електронната микроскопия на биологичните обекти се използват специални методи за приготвяне. Това е необходимо, за да се идентифицират отделните компоненти на изследваните обекти (вирус), както и да се запази структурата им при високи вакуумни условия под електронния сноп.

С помощта на електронната микроскопия се изследва външната форма на обекта, молекулярната организация на повърхността й, като се използва методът на ултра тънки сечения, се изследва вътрешната структура на обекта.

Електронна микроскопия в комбинация с биохимични, цитохимични методи на изследване, имунофлуоресценция и рентгенов анализ осигурява прозрения за състава и функциите на структурните елементи на клетки и вируси.

Електронната микроскопия на вирусите, оцветени с метода на негативно контрастиране, позволява диференциране на вирусите и определяне на тяхната концентрация. Използването на електронна микроскопия при диагностицирането на вирусни инфекции е ограничено до случаи, при които концентрацията на вирусни частици в клиничния материал е достатъчно висока (105 в 1 ml или повече).

Недостатъкът на метода е невъзможността да се прави разлика между вируси, принадлежащи към една и съща таксономична група. Този дефицит се елиминира чрез използването на имунна електронна микроскопия.

Методът се основава на образуването на имунни комплекси, когато специфичен серум се добавя към вирусни частици, докато едновременната концентрация на вирусни частици позволява да се идентифицират. Методът се използва и за откриване на антитела. За целите на изричната диагностика се извършва електронно-микроскопско изследване на екстракти от тъкани, фекалии, течност от везикули, тайни от назофаринкса.

Електронната микроскопия се използва широко за изследване на морфогенезата на вируса, неговите възможности се разширяват чрез използването на белязани антитела.

ИМУНИЕЕЛЕКТРОНИЧНА МИКРОСКОПИЯ

Това е пряка визуализация на взаимодействието на антигена и антителата чрез електронна микроскопия, за първи път е предложена за вирусологични изследвания от J. Almeida и A. Waterson през 1969.

Методически, тестът за IEM се извършва в следната последователност:

1. Материалът, в който се предполага наличието на вирус, се смесва и се инкубира със стандартен имунен серум;

2. Комплексът вирус-антитяло се утаява чрез центрофугиране в подходящи схеми;

3. Към ресуспендираната утайка се прибавя контрастно средство и полученият препарат се изследва под електронен микроскоп.

В случай на положителна реакция се разкриват характерни агрегати, състоящи се от вирусни частици, свързани чрез мостове на антитела. Прагът на чувствителност на IEM е малък: надеждно откриване на вируса е осъществимо, когато концентрацията му в изходния материал е 10 ^ 4 - 10 6 частици / ml.

Предимството на метода е способността да се оценява не само резултатът от серологичната реакция, но и да се идентифицира неговият морфологичен субстрат, т.е. да се определи формата и размерът на вирусните частици. В присъствието на препарати от вирус с известно съдържание на частици, IEM може да се използва за количествено определяне на антитела в sera, за които се предлага специална система за записване на интензивността на взаимодействие на вируса и антителата.

Серологични методи в Virology въз основа на класически имунологични реакции: Реакциите за свързване на комплемента, инхибиране хемаглутинацията, биологични неутрализация, имунодифузия, непряко хемаглутинацията, радиална хемолиза, имунофлуоресценция, ензимен имуноанализ, радиоимуноанализ. Бяха разработени микрометодите от много реакции, техниката им непрекъснато се подобрява.

Тези методи са използвани за идентифициране на вируси се използват известни набор от серуми за serodiagnosis и за определяне на растежа на антитяло във втората серума в сравнение с първата (първата серум взето след първите няколко дни на заболяването, а вторият -. След 2-3 седмици). Диагностичната стойност е не по-малко от четирикратно увеличение на антителата във втория серум. Ако откриването на IgG антитела показва скорошна инфекция, IgG антителата продължават да съществуват в продължение на няколко години, а понякога и за цял живот. За да се идентифицират отделни антигени от вируси и антитела срещу тях в комплексни смеси без предварително пречистване на протеини, използвайте имуноблотинг.

Методът комбинира протеинова фракциониране чрез електрофореза в полиакриламиден гел, последвано от имуноанализ на протеини чрез ензимен имуноанализ. Разделянето на протеини намалява изискванията за химическата чистота на антигена и позволява идентифицирането на отделни двойки антиген-антитяло. Този проблем е важно, като serodiagnosis на ХИВ, където фалшиви положителни реакции имуноанализ поради наличието на антитела към клетъчни антигени, които съществуват в резултат на недостатъчно почистване на вирусни протеини.

Идентифицирането на антителата в серумите на пациентите на вътрешни и външни вирусни антигени позволява да се определи степента на заболяването и при анализа на популациите - вариабилността на вирусните протеини.

Имуноблотирането при HIV инфекция се използва като потвърдителен тест за откриване на отделни вирусни антигени и антитела към тях. При анализа на популациите методът се използва за определяне на променливостта на вирусните протеини.

Голямата стойност на метода се състои в възможността за анализ на антигени, синтезирани чрез рекомбинантна ДНК технология, установяване на техния размер и наличие на антигенни детерминанти.

вирусен молекулярен хибридизационен микроскоп

Имунофлуоресцентен метод или имунофлуоресцентна реакция (RIF) се използва в микробиологични лаборатории, оборудвани с флуоресцентен микроскоп.

В проучването се използват директни и индиректни имунофлуоресцентни реакции.

Когато се използва директна реакция на имунофлуоресценция за диагностика, клиничен материал, фиксиран с етанол, се прилага върху плъзгача.

След това се добавя луминесцентен серум. Извършвайте изследването на лекарството под луминисцентен микроскоп.

Имунологичната реакция на антигена-антитяло се извършва директно върху слайда. Например, грипният антиген, който се свързва с белязания имуноглобулин под микроскоп, изглежда като ярко сияещи частици, разположени в ядрото и цитоплазмата на заразените клетки. Методът е прост, но изисква луминисцентни серуми за всеки тип антигени.

Същността на индиректната реакция на имунофлуоресценцията е, че първо върху плъзгащия се антиген се свързва със специфичен (небелязан) серум. Луминесцентният серум се добавя към комплекса антиген-антитяло, образуван върху стъклото.

Последната стъпка е микроскопия, която идентифицира означените комплекси.

Този метод консумира малко количество луминисцентни серуми, така че е широко използван за откриване на бактериални, рикетсиални пневмоцитисни инфекции.

Той улеснява идентифицирането на грипни вируси, параинфлуенца, аденовируси, респираторен синцитиален вирус, цитомегаловирус. Диагнозата на легионела и хламидиална инфекция също трябва да се извърши чрез имунофлуоресцентна реакция за определяне на подходящия антиген.

МЕТОД НА МОЛЕКУЛНА ХИБРИДИЗАЦИЯ

Методът на молекулярната хибридизация, основаващ се на откриването на вирусно-специфични нуклеинови киселини, прави възможно откриването на единични копия на гените и е несравнимо с степента на чувствителност.

Реакцията се основава на хибридизацията на комплементарните вериги на ДНК или РНК (проби) и образуването на двойно-верижни структури. Най-евтината сонда е клонирана рекомбинантна ДНК. Сондата е белязана с радиоактивни прекурсори (обикновено радиоактивен фосфор). Проспективно използване на колориметрични реакции.

Има няколко варианта на молекулярната хибридизация: точкова, блотирана хибридизация, сандвич хибридизация, in situ хибридизация и т.н.

СПИСЪК НА ИЗПОЛЗВАНАТА ЛИТЕРАТУРА

1) Лабораторна диагностика на вирусни инфекции, NN Nosik, V.M. Stakhanov

2) Институт по вирусология. D. и. Иваново RAM памети, Москва ; лаборатория диагноза от вирусен Инфекции, N.N. Nosik, V.M. Stachanova

3) Атлас на анатомията и онтогенезата на човешки и животински вируси, AA Avakyan, AF Bykovskii, 1970

4) Планетата на вирусите, Карл Цимер, 2012

5) http://www.serdechno.ru/enciklopediya/3171.html