Ветеринарни технологии

Захранване

Принцип. Протеините реагират в алкална среда със сярна мед; образувайки по този начин съединения, оцветени в виолетови.
Реагенти. 1. 0.9% разтвор на натриев хлорид.
2. 0.2 N; (0,2 mol / l) разтвор на натриев хидроксид, без въглероден диоксид. 8 тона от веществото се вкарва в обемна колба за 1 литър и се излива в марката с варена дестилирана вода или се приготвя от 1N. (mol / L) разтвор на сода каустик: 20 ml 1 N солна киселина. Разтворът на NaOH се довежда до 100 ml с варена дестилирана вода.
3. Биуретният реагент е основен. 4,5 г сол на Рошел (KNaS4N4O6) се разтварят в мерителна колба от 100 мл в 40 мл 0.2N. разтвор на сода каустик. След разтваряне се добавят 1,5 g меден сулфат (CuS04 * 5H2O) и 0,5 т калиев йодид (KI). Разбърква се до пълно разтваряне и довежда до 100 ml 0,2 N. разтвор на сода каустик. Съхранявайте в купа с тъмно стъкло. Реактивът е стабилен. 4. 0.5% разтвор на калиев йодид в 0.2N. разтвор на сода каустик. Към 500-милилитрова мерителна колба се добавят 2,5 g калиев йодид и се напълват до марка 0,2 N. разтвор на сода каустик. Съхранявайте в купа с тъмно стъкло не повече от 2 седмици.
5. Работен разтвор на биуретен реагент. Смесва се една част от основния разтвор на биурет (3) с четири части 0,5% разтвор на калиев йодид (4). Съхранявайте в хладилник в тъмни съдове не повече от 2 седмици.
6. Стандартен албуминов разтвор, основен. Тръбата е направена от 1 г кристален серум (от човешки или волски серум) албумин и 9 мл 0,9% натриев hlorpstogo разтвор. Разбъркайте добре. 1 ml от разтвора съдържа 0,1 g протеин. Да се ​​съхранява в хладилник. Серумен албумин трябва да отговаря на изискванията на стандарта.
Оборудване. photoelectrocolorimeter; луковиците се измерват.
Курсът на определението. Към 0,1 ml кръвен серум се добавят 5 ml от работния разтвор на биуретния реагент, смесват се, като се избягва образуването на хелий. След 30 минути (но не по-късно от 1 час) оптичната плътност се измерва при FEKe в кювета с дебелина на слоя 1 cm при дължина на вълната 540-560 нм (зелен филтър) срещу контрола (5 мл работен разтвор на биурет реагент и 0.1 мл 0, 9% разтвор на натриев хлорид).
Изчислението се извършва съгласно калибриращ график, за чието изграждане се приготвят стандартни стандартни разтвори на основния стандартен разтвор на 10% протеин (Таблица 5).
5. Приготвяне на работещи стандартни протеинови разтвори
От всяко (от 4) разреждания в 5 епруветки се добавят и обработват 0.01 ml албуминов разтвор, както и кръвният серум.
Измерванията на оптичната плътност на стандартните разтвори започват с разтвор с най-ниска концентрация. От получените средни данни се съставя калибрационна крива от 5 определяния. Кривата на калибриране се проверява периодично.
Пример з а н д и аз. 1. Протеиновото съдържание на стандартен разтвор трябва да бъде най-малко 7%. 2. Когато съдържанието на протеин в серума на повече от 10% последната fiziologvcheskim разреден разтвор на 1: 1, в резултат на ножа, умножена по две. Грешка в метода 2%.
Източник: Клинична лабораторна диагностика във ветеринарната медицина: справочна книга / ПР. Kondrakhin, N.V. Kurilov, A.G. Малахов и д-р -M: Agropromizdat, 1985.-287р.

Лабораторна диагностика

Бързо търсене в сайта

Споделяне в социалните мрежи

Прочетете ни на адрес:

Намерихте ли грешка? Изберете го с мишката и натиснете едновременно Ctrl + Enter Orphus system

Методи за определяне на общия протеин в серума

Референтните стойности на концентрацията на общия протеин в серума са 65-85 g / l

2. Определяне на специфичното тегло на серума

3. Теглото (гравиметрично), когато се утаяват кръвните протеини, изсушават се до постоянно тегло и се претеглят на аналитични скали.

1. Рефрактометър IRF-454 Б2М

е предназначен за определяне на протеини в кръвния серум, цереброспинална течност, контрол на лекарствената концентрация, измерване на плътността на урината.

2. Cobas integra - Total Protein Gen.2

Принцип на теста: двувалентната мед реагира в алкален разтвор с белтъчни пептидни връзки, за да образува характерен пурпурен цвят на биуретен комплекс.

3. Определяне на протеинови фракции на кръвния серум чрез електрофореза върху филм от целулозен ацетат.

Буферният разтвор е предназначен за електрофоретично разделяне на серумните протеини върху мембраните на целулозния ацетат, последвано от денситометрично определяне на протеиновите фракции.

Принципът на електрофоретичното отделяне на протеините се основава на различната скорост на движение на молекулите на серумните протеини в постоянно електрическо поле с определен интензитет. Отделените протеинови фракции се оцветяват с багрило. Интензитетът на оцветяване на протеиновите фракции е пропорционален на техния брой.

Кръвен серум, свободен от хемолиза, липемия, а не иктеричен. Протеиновите фракции на кръвния серум са стабилни в плътно затворена епруветка при 18-25 часа в продължение на 8 часа, при 2-8 за 3 дни, при 20 за 1 месец.

1. Електрофореза

1.1. сухите мембрани леко се поставят върху повърхността на електрофорезовия буфер, избягвайки бързото им потапяне и се накисват до пълно намокряне. Намокрете запечатаните мембрани внимателно между листовете гъста филтърна хартия, за да не изсъхнат. Преди да приложите пробите, препоръчително е да проведете предварително фаза. За да направите това, мембраната трябва да се постави в електрофореза и да включите тока в избрания режим за 10 минути. Фазата на предварително нарязания може да бъде заменена от продължително накисване на мембраната в буферния разтвор (няколко часа).

1.2. с помощта на апликатор, приложете анализираните серумни проби на разстояние 2-3 cm от края на катода на мембраната. Поставете мембраната в електрофоретичната камера и свържете тока.

2. Обработка на електрофореграмата

2.1. оцветител Crimson S.

След изключване на тока внимателно прехвърлете мембраната в разтвор на багрилото в продължение на 3-5 минути, след това два пъти в продължение на 3 минути в 5-7% разтвор на оцетна киселина (преди избелване на фона).

1.2. Електрофореграмата трябва да се обработва с помощта на скенер и компютърна програма.

4. Тим

Серумни бета-глобулини, гама глобулини и липопротеини се утаяват при рН 7.55 с тимолов реагент. В зависимост от количеството и взаимното съотношение на протеиновите фракции се развива мътност в реакцията, чиято интензивност се измерва турбидиметрично.

Тимоловия тест е по-подходящ за функционален преглед на черния дроб, отколкото колоид-устойчивите проби. Счита се, че той е положителен при 90-100% от случаите на болестта на Botkin (вече в пред-артритен стадий и без ануса) и с токсичен хепатит. Реакцията е положителна за пост-хепатит и постнекротична, особено иктерична цироза (за разлика от други форми на цироза), с колагенови заболявания, малария и вирусни инфекции. При механична жълтеница тя (в 75% от случаите) е отрицателна, която има диференциална диагностична стойност.

При механична жълтеница пробата става позитивна само ако процесът е усложнен от паренхимен хепатит. За диференциацията на механичната жълтеница от паренхиматоидите, използването на тимолова проба с теста на Бърстейн (за бета и бета-бета-алфапротеини) е от голямо значение.

При паренхимна жълтеница двете проби са положителни, с механична жълтеница, тимолният тест е отрицателен, тестът на Burstein е рязко положителен.

Общ протеин

Всички известни методи за определяне на концентрацията на общия протеин се разделят на следните групи:

1. Азотометрична, въз основа на определянето на количеството протеинов азот, за да се намери протеиновата концентрация, произтича от факта, че съдържанието на азот в протеините е 16%, поради което се използва коефициентът 6.25. Методът е неточен, тъй като съдържанието на азот в различните протеинови молекули варира от 14 до 19%.

2. Методите, които се състоят в определяне на серумна плътност - методът на плаваща капка, също са неточни поради влиянието върху плътността на другите вещества, присъстващи в серума.

3. Тежест (гравиметрично) - много труден и изисква големи количества серум.

4. Рефрактометрични методи - лесни за изпълнение, но неточни, тъй като пречупването на серума се обуславя и от минерални вещества и въглехидрати.

5. Колориметрична, базирана на цветните реакции на протеините:

  • методи, основани на багрило неспецифично свързване (прост абсорбция) са чувствителни достатъчно, но степента на свързване на багрилото зависи от индивидуалните свойства на протеина (метод Coomassie Brilliant Blue).
  • биурет тест - най-широко използваните в момента, на базата на специфичната реакция на пептидната връзка с медни йони в алкална среда, за да се образува пурпурен продукт. Има различни модификации на този метод с цел да се увеличи интензивността на цвета и неговата стабилност, като се увеличи стабилността на реагента. Например, тартарат се прибавят като стабилизатор, който при комплексообразуване с медни йони предотвратява тяхното утаяване в алкална среда, KJ предотвратява спонтанно възстановяване алкален меден тартарат и депозиране на меден оксид и следователно подобрява стабилността на реагента. Чувствителността и специфичността на метода зависят от използваната дължина на вълната: 540-580 nm, 263 nm или 310 nm. Методът се счита за най-конкретни и точни, тъй като присъствието на ароматни аминокиселини, феноли, пикочна киселина не влияе на реакцията на биурет.
  • метод Lowry - въз основа на образуването на волфрам и молибден синьо от синьо фосфомолибденова и фосфоволфрамова соли реагент Фолин Chikolte чрез взаимодействие с ароматни аминокиселини, тирозинови остатъци обикновено, но известна помощ е триптофан, хистидин, цистеин. Максималната абсорбция е в обхвата 745-750 nm. В работния реагент има биуретен реагент, който позволява също да се определят пептидни връзки. Недостатъци на метода са: първо, отрицателно влияние върху развитието на цвят материали, използвани за изолирането, пречистването и разтварянето на протеини (детергент, буферни системи, компоненти и други сулфхидрилни редуциращи агенти, пурин, глицин, захароза, амониев сулфат, и т.н.); второ, отсъствието на линейна зависимост на интензивността на цвета върху количеството протеинов стандарт. Методът е по-чувствителен от биурет, но специфичност е по-ниска, като интензивността на цвета зависи от протеин амино състав киселина и последователност на аминокиселините и степента на екраниране на функционалните групи.

6. Нефелометрични методи.

7. Поляриметрични методи.

8. Спектрофотометричен се състои в измерване на степен cvetopogloscheniya в ултравиолетовата област на две дължини на вълните с допълнително изчисление съгласно специални формули (230 и 260 пМ, 280 пМ и 260, 235 и 280 пМ, 215 пМ и 225, 280 и 205 нанометра).

Единни методи

Единни методи за определяне на общия протеин са:

  • в кръвния серум - биоуретен метод;
  • в урината, полуколичествения метод на Бранденбург-Робертс-Столинов и нефелометрия (590-650 nm) след реакция със сулфосалицилова киселина;
  • в течност - нефелометрия (410-480 nm) след реакция със сулфосалицилова киселина и натриев сулфат;
  • в течността на серозни кухини - нефелометрия (590-650 nm) след реакция със сулфосалицилова киселина.

Определяне на количеството на общия протеин
в кръвния серум, използвайки метода на биорет

принцип

Протеините реагират в алкална среда с меден сулфат, образувайки хелатни съединения с виолетов цвят. Интензитетът на цвета е пропорционален на броя на пептидните връзки.

Методи за определяне на общия протеин в серума

Референтните стойности на концентрацията на общия протеин в серума са 65-85 g / l

2. Определяне на специфичното тегло на серума

3. Теглото (гравиметрично), когато се утаяват кръвните протеини, изсушават се до постоянно тегло и се претеглят на аналитични скали.

1. Рефрактометър IRF-454 Б2М

е предназначен за определяне на протеини в кръвния серум, цереброспинална течност, контрол на лекарствената концентрация, измерване на плътността на урината.

2. Cobas integra - Total Protein Gen.2

Принцип на теста: двувалентната мед реагира в алкален разтвор с белтъчни пептидни връзки, за да образува характерен пурпурен цвят на биуретен комплекс.

3. Определяне на протеинови фракции на кръвния серум чрез електрофореза върху филм от целулозен ацетат.

Буферният разтвор е предназначен за електрофоретично разделяне на серумните протеини върху мембраните на целулозния ацетат, последвано от денситометрично определяне на протеиновите фракции.

ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Принципът на електрофоретичното отделяне на протеините се основава на различната скорост на движение на молекулите на серумните протеини в постоянно електрическо поле с определен интензитет. Отделените протеинови фракции се оцветяват с багрило. Интензитетът на оцветяване на протеиновите фракции е пропорционален на техния брой.

АНАЛИЗИРАНИ ПРОБИ

Кръвен серум, свободен от хемолиза, липемия, а не иктеричен. Протеиновите фракции на кръвния серум са стабилни в плътно затворена епруветка при 18-25 часа в продължение на 8 часа, при 2-8 за 3 дни, при 20 за 1 месец.

ПРОВЕЖДАНЕ НА АНАЛИЗ

1. Електрофореза

1.1. сухите мембрани леко се поставят върху повърхността на електрофорезовия буфер, избягвайки бързото им потапяне и се накисват до пълно намокряне. Намокрете запечатаните мембрани внимателно между листовете гъста филтърна хартия, за да не изсъхнат. Преди да приложите пробите, препоръчително е да проведете предварително фаза. За да направите това, мембраната трябва да се постави в електрофореза и да включите тока в избрания режим за 10 минути. Фазата на предварително нарязания може да бъде заменена от продължително накисване на мембраната в буферния разтвор (няколко часа).

1.2. с помощта на апликатор, приложете анализираните серумни проби на разстояние 2-3 cm от края на катода на мембраната. Поставете мембраната в електрофоретичната камера и свържете тока.

2. Обработка на електрофореграмата

2.1. оцветител Crimson S.

След изключване на тока внимателно прехвърлете мембраната в разтвор на багрилото в продължение на 3-5 минути, след това два пъти в продължение на 3 минути в 5-7% разтвор на оцетна киселина (преди избелване на фона).

1.2. Електрофореграмата трябва да се обработва с помощта на скенер и компютърна програма.

4. Тим

Серумни бета-глобулини, гама глобулини и липопротеини се утаяват при рН 7.55 с тимолов реагент. В зависимост от количеството и взаимното съотношение на протеиновите фракции се развива мътност в реакцията, чиято интензивност се измерва турбидиметрично.

Тимоловия тест е по-подходящ за функционален преглед на черния дроб, отколкото колоид-устойчивите проби. Счита се, че той е положителен при 90-100% от случаите на болестта на Botkin (вече в пред-артритен стадий и без ануса) и с токсичен хепатит. Реакцията е положителна за пост-хепатит и постнекротична, особено иктерична цироза (за разлика от други форми на цироза), с колагенови заболявания, малария и вирусни инфекции. При механична жълтеница тя (в 75% от случаите) е отрицателна, която има диференциална диагностична стойност.

При механична жълтеница пробата става позитивна само ако процесът е усложнен от паренхимен хепатит. За диференциацията на механичната жълтеница от паренхиматоидите, използването на тимолова проба с теста на Бърстейн (за бета и бета-бета-алфапротеини) е от голямо значение.

При паренхимна жълтеница двете проби са положителни, с механична жълтеница, тимолният тест е отрицателен, тестът на Burstein е рязко положителен.

Общ протеин, неговата значимост и методи за определяне (Страница 1 от 2)

МУСЕ «КЛИНИЧНА БОЛНИЧНА БОЛНИЦА НА АМБУЛАНСКАТА СЛУЖБА»

МЕЖДУНАРОДЕН МЕЖДУНАРОДЕН УНИВЕРСИТЕТ

КУРС НА КЛИНИЧНАТА ЛАБОРАТОРНА ДИАГНОСТИКА

Общ белтък, неговата значимост и методи за определяне

Архангелск, 2008 г.

Протеини от кръвна плазма

Методи за определяне на общия протеин в серума

Списък на използваната литература

Протеините са високомолекулни органични азотсъдържащи съединения, състоящи се от повече от 20 вида алфа-аминокиселини. Кондиционалната граница между големи полипептиди и протеини е молекулното тегло от 8000 до 10000. Плазмените протеини се синтезират основно в черния дроб, плазмените клетки, лимфните възли, далака и костния мозък.

Плазмата от човешка кръв съдържа повече от 100 различни протеини, които се различават по произход и функции. От 9-10% от сухия остатък на кръвната плазма съотношението на протеините е 6.5-8.5%.

· Прости (протеини) (съдържат само аминокиселини)

· Комплексни (протеини) (аминокиселини и не-аминокиселинни компоненти: хема, витаминови производни, липиди или въглехидрати)

· Фибрил (образуващи много плътни тъкани)

· Глобулини (албумини (4-5%), глобулини (2-3%), фибриноген (0.2-0.4%)

Съществуват следните функционални класове протеини:

- Транспортни белтъци (трансферин)

- Протеините от острата фаза (С-реактивен протеин)

- Протеините от острата фаза (албумин, трансферин)

- Фактори на комплемента и съсирването (комплемент С4, фактор VIII)

- Антифенмент (антитромбин III)

- Протеини, чиито функции не са достатъчно проучени (алфа-гликопротеинова киселина)

Физиологичната функция на плазмени протеини е да се поддържа колоид осмотичното налягане, буфер капацитета на плазмата, в някои случаи - на депозит (съхраняване) на липидни молекули, метаболитни продукти, хормони, лекарства и минерали. Някои плазмени протеини изпълняват ензимна функция, имуноглобулините изпълняват хуморален имунитет. Допълват компоненти и С-реактивен протеин са важни за неспецифично устойчивост, особено в случая на бактериални инфекции. Равновесието между факторите и инхибиторите на коагулацията осигурява течно кръвно състояние в нормата и бързо коагулиране в случай на травма

Протеини от кръвна плазма

Normable стойност 56.5 - 66.8 (В серум албумин за приблизително 60% от общия протеин, синтезиран в черния дроб албумин (около петнайсетграм / ден), докато им полуживот е около 17 дни в плазма онкотично налягане поради 65-80% албумин Албумини работи... транспортиране важна функция на много биологично активни вещества, по-специално хормони. Те са способни да се свързват към холестерол, билирубин. Голяма част от калций в кръвта също е свързан с албумин. албумин може да се свързва с различни лекарства.

Качествени и количествени промени в плазмения албумин са възможни. Качествените промени в албумини са много редки поради хомогенния състав на тази протеинова фракция; количествените промени се проявяват чрез хипер- и хипоалбуминемия.

Хипералбуминемията се наблюдава при дехидратация в случаи на тежки наранявания, при продължителни изгаряния, холера.

Хипоалбуминемия са първични (при деца поради незрялост на чернодробните клетки) и вторична, поради различни патологични условия, подобни на тези, които причиняват хипопротеинемия. При намаляване на концентрацията на албумини, хемодилуцията може също да играе роля, например при бременност. Намаляването на съдържанието на албумин под 22-24 g / l е придружено от развитието на белодробен оток.)

· Alpha 1 - 3.5 - 6.0 (основните компоненти на тази фракция включват α1 антитрипсин, а1 - липопротеин, киселина а1 - гликопротеин) (Промяна на фракцията α1 - глобулини се наблюдават при остри, подостри, екзацербация на хронични възпалителни процеси; увреждане на черния дроб; всички процеси на тъканно разпадане или клетъчна пролиферация. Намаляване на α1 - глобулините се наблюдават с дефицит α1 - антитрипсин, хипо-а1 - липопротеинемия.)

· Alpha 2 - 6.9 - 10.5 (фракцията съдържа α2 - макроглобулин, хаптоглобин, алипопротеини А, В (апо-А, апо-В), С, церулоплазмин) (увеличение на2 - глобулини се наблюдават при всички видове остри възпалителни процеси, особено при изразен ексудативен и гноен характер (пневмония, емпием на плеврата, други видове гнойни процеси); заболявания, свързани с включването на съединителната тъкан в патологичния процес (колагенози, автоимунни заболявания, ревматични заболявания); злокачествени тумори; в етапа на възстановяване от топлинни изгаряния; нефротичен синдром; хемолиза на кръвта in vitro. Намаляване на фракцията се наблюдава при захарен диабет, панкреатит (понякога), вродена жълтеница с механичен произход при новородени, токсичен хепатит. K α2 - Глобулините включват по-голямата част от протеините на острата фаза. Увеличаването на тяхното съдържание отразява интензивността на стрес реакцията и възпалителните процеси в посочените видове патология.

· Бета - 7.3 - 13.0 (β-фракция, съдържаща трансферин, hemopexin, допълва компоненти, имуноглобулин и липопротеини) (увеличение бета глобулин фракции се открива от първичен и вторичен хиперлипопротеинемия, чернодробни заболявания, нефротичен синдром, кървяща язва, хипотиреоидизъм Намаляване съдържанието на стойност. бета-глобулин се открива с гопо-бета-липопротеинемия.

· Гама - 12,8 - 19,0 (γ-фракция съдържа Ig (IgG, IgA, IgM IgD, IgE), по този начин увеличава съдържанието на у-глобулин посочи система имунитет реакция, когато мощност АТ и автоантитела: в вирусни и бактериални инфекции, възпаление,. колагеноза, разграждане на тъкани и много изгаряния хипергамаглобулинемия, отразявайки възпалителен процес активност е типична за хронично активен хепатит и цироза на черния дроб Повишаване фракция γ -. глобулини наблюдавани при 88-92% от пациентите с хроничен активен хепатит (в който 60-65% от пациентите е изключително изразена -. до 26 г / л и по-горе) почти същите промени, отбелязани при пациенти с висока активност и напреднала цироза на черния дроб, а често съдържание γ-глобулин надвишава съдържанието на албумин, който се счита за лошо прогностичен знак.

В някои заболявания на възможно повишена синтеза на протеини, които попадат в рамките на фракцията γ-глобулин, и се появяват в кръвоносните патологични протеини - парапротеини които се откриват чрез електрофорезата. За да се изясни естеството на тези промени, е необходима имуноелектрофореза. Подобни промени се наблюдават при миелома, болестта на Waldenstrom.

Увеличаване на съдържанието на г-глобулини в кръвта също се наблюдава при ревматоиден артрит, SLE, хронична лимфоцитна левкемия, ендотелиом, остеосарком, кандидомикоза.

Намаляването на съдържанието на γ-глобулин е първично и вторично.

Има три основни вида първична хипогамаглобулинемия: физиологична (при деца на възраст 3-5 месеца), вродена и идиопатична. Причините за вторична хипогамаглобулинемия могат да бъдат множество заболявания и състояния, водещи до изчерпване на имунната система.

Сравнението на посоката на промяна в съдържанието на албумин и глобулин с общите промени съдържанието на протеини осигурява база за заключение, че albuminosis често се свързва с hyperglobulinaemia, докато хипопротеинемия обикновено се дължи на хипоалбуминемия. В миналото често се използва изчисляване на съотношението албумин-глобулин, т.е. съотношението на фракцията на албумин в размер на глобулин фракция. Обикновено тази цифра е 2,5-3,5. При пациенти с хроничен хепатит и цироза на черния дроб, това съотношение е намалено до 1.5 до 1, а дори и чрез намаляване фракции албумин и глобулин увеличи. През последните години все повече и повече внимание се обръща на определяне на съдържанието на преалбумин, особено при пациенти тежки интензивните отделения за парентерално хранене. Намаляване на концентрацията на преалбумини - ранен и чувствителен тест за недостиг на протеини в тялото на пациента.)

Коефициентът A T обикновено се използва като индекс на съотношението на албумина към глобулина.

Промени в този коефициент могат да се наблюдават при цироза, гломерулонефрит, нефротичен синдром, остър хепатит, системен лупус еритематозус.

Концентрацията на протеините в кръвната плазма зависи от съотношението между скоростта на техния синтез и екскреция от тялото, както и обема на разпределение.

Много протеини се образуват в черния дроб, плазмените клетки и лимфоцитите синтезират имуноглобулини, макрофагите са протеини от системата на комплимента. Пасивната загуба на белтъци с ниско молекулно тегло настъпва през бъбречните гломерули и чревната стена. Някои от тези протеини се подлагат на ре-абсорбция или се улавят и разцепват в чревната лигавица. Повечето плазмени протеини след улавянето им чрез пиноцитоза се катаболизират в ендотелни клетки от капиляри или мононуклеарни фагоцити.

Физиологичните роли на протеините от кръвта са многобройни, основните са следните:

· Поддържане на колоидно-онкотично налягане, поддържане на обема на кръвта, свързване на водата и задържането й, като не се позволява да напусне кръвта;

· Участвайте в кръвосъсирването;

· Поддържане на постоянството на кръвта Rn, образувайки една от буферните системи на кръвта;

· Свързване с няколко вещества (холестерол, билирубин и др.), Както и с лекарства, те се доставят в тъканите.

· Поддържат нормални нива на кръвни катиони чрез образуване на съединения с тях undialyzed (например, 40-50% серумния калций поради протеини, значителна част от желязо, мед, магнезий и други следи от елементи също така са свързани с протеини);

4. Определяне на общия протеин в кръвния серум според биуретната реакция

Определянето на общия протеин чрез биуретна реакция е най-честата метод за определяне на общия протеин в серума. Методът е сравнително евтин, опростен и има добра възпроизводимост и специфичност, като се използва като ви дава възможност да учат и двете анализатори (автоматични и полуавтоматични) и конвенционален фотометър.

Протеините реагират в алкална среда с меден сулфат, за да образуват сложни съединения, оцветени в виолетови. Интензивността на оцветяването, която е пропорционална на количеството на протеина, определя неговото съдържание в кръвния серум.

За да се определи общия кръвен протеин с биуретна реакция, е желателно да вземате кръв сутрин на празен стомах.

Натриев хлорид, ppm a. или х. ч., 154 mmol / l (изотоничен разтвор): 9 g натриев хлорид се поставят в 1-литрова обемна колба, разтварят се във вода и се довеждат до марката с вода.

Натриев хидроксид, pbw a. или х. h, 0,2 mol / l: 8 g сода каустик се поставя в 1-литрова мерителна колба, внимателно се разтваря във вода и се довежда до марката с вода.

Калиев йодид, кат. или х. часа, 30 ммол / л разтвор на калиев йодид в 0.2 мол / л разтвор на натриев хидроксид :. 0,5 г калиев йодид се поставят в мерителна колба от 100 мл, се довежда до 0.2 мол / л разтвор на натриев хидроксид до марката и се разтваря. Реактивът е стабилен в продължение на 2 седмици, когато се съхранява в табла от тъмно стъкло.

Калиев натриев тартрат 4-вода (сол Rochelle) стр.

Меден сулфат 5-часов час. или х. ч.

Биуретът реагент: 4,5 г сол на Рошел се разтварят в 40 мл 0.2 мол / л разтвор на натриев хидроксид се прибавят 1,5 г меден сулфат и 0,5 г калиев йодид и се разтваря. Довежда до 100 мл 0.2 мол / л NaOH реагент е стабилна, когато се съхранява в контейнери от тъмно стъкло е не повече от един месец.

Работен разтвор на биуретен реагент: 20 ml биуретен реагент се смесва с 80 ml 0,5% разтвор на калиев йодид. Реактивът се съхранява на тъмно място за не повече от 2 седмици.

разтвор за калибриране албумин (от човешки или волски серум) - 100 г / л на албумин в / л разтвор на 154 ммола натриев хлорид: 1 г от човешки албумин или говежди серум разтваря в 6-7 мл от 0,9% разтвор на натриев хлорид и изотонични регулира разтвор на натриев хлорид до обем от 10 ml; 1 ml от стандартния разтвор съдържа 0,1 g протеин.

Материал за изследване

Серум и плазма могат да се използват за анализ. В този случай обикновено се получават сравними резултати, въпреки че поради наличието на фибриноген, нивото на общия протеин в плазмата е 2-4 g / l по-високо, отколкото в серума.

Определянето на съдържанието на серумен протеин, получено във вакуумни системи със и без отделяне на гел дава сравними резултати. Няма значителна разлика в съдържанието на протеини в кръвните проби, събрани в стъклени или пластмасови вакуумни системи.

За проучване не трябва да се използва хемолизирани серум, както и хемоглобин е протеин и ще се присъедини към реакцията на биурет, което ще доведе до фалшиво повишени анализни резултати: Наличие на хемоглобин води до надценяване на 3% за всеки 1 г / л свободен хемоглобин в серума.

Нежелателно е да се използва хилозен серум, тъй като той ще се намесва оптично с резултатите от определянето поради мътност и следователно води до фалшиво надценяване на резултатите. За да се елиминира смущенията, причинени от значителна липемия, се използва екстракция с диетилов етер. При незначително присъствие на липиди е възможно да се извърши проучване, като се установи "празна проба" върху пробата на пациента или се разрежда пробата с изотоничен разтвор на натриев хлорид и след това резултатът се умножава по скоростта на разреждане.

Интерфериращият ефект има билирубин при концентрация повече от 85 μmol / l. Следователно, в случай на хипербилирубинемия се използва серумно разреждане или "празна" настройка за пробата на пациента.

В някои случаи, реакцията може да се намесва с лекарства, използвани за лечение, особено при критично болни пациенти. Например, декстрани се използват като плазма заместване решения са в комплекс с мед и тартарат в реакционната смес и да доведе до образуването на свободно синьо утайка. Степента на намеса зависи от концентрацията на декстран и състава на биуретния реагент. Когато обикновено се прилага количеството декстран, стойността на грешката може да бъде от 3 до 50%. Смята се, че добавянето на глицерол в реактива или с помощта на ниска концентрация на NaOH, способен да предотврати смущението на декстран в реакцията. Наличието на амониеви йони в пробата може да подпомогне образуването на амониеви комплекси с медни йони, води до намаляване на концентрацията на медни йони в реакционната среда, и съответно да се намали скоростта на реакцията и фалшиви отрицателни резултати. В редки случаи, смущения на лекарства, които са в серума е, че взаимодействието на биурет реагент със серум наблюдава всяко развитие цвят, който е различен от виолетово, или появата на помътняване. Не е възможно да се изчисли количеството протеин в такъв серум.

Общото съдържание на протеини е стабилно в серума и плазмата за 1 седмица при стайна температура и поне 2 месеца при -20 ° С.

Процесът на определяне на общия протеин в серума в съответствие с биуретната реакция

Проба за изпитване: Към 0,1 ml серум се добавят 5 ml от работния разтвор на биуретното вещество и се разбърква, като се избягва образуването на пяна. След 30 минути (и не по-късно от един час) се измерва с фотометър в кювета с дебелина на слоя от 1 cm при дължина на вълната от 500-560 nm (зелен светлинен филтър) срещу празна проба.

Празен тест: добавете 0,1 ml 154 mmol / l разтвор на натриев хлорид към 5 ml от работещия биоуретен реактив, след което го третирайте като проба за анализ.

Изчислението се извършва съгласно графика за калибриране.

Изготвяне на графиката за калибриране: от разтвора за калибриране се приготвят работни разтвори, както е посочено по-долу.

Методи за определяне на общия протеин в серума

Протеините от серума са хетерогенна група протеини, включително транспортни протеини, ензими, имуноглобулини, хормони, инхибиторни протеини и много други. Въпреки разликите в състава, структурата, физичните и химичните свойства и извършената функция, серумните протеини имат редица общи характеристики:

  1. съдържат въглеродни атоми, водород, кислород, азот;
  2. се състоят от аминокиселини, свързани чрез пептидни връзки;
  3. Абсорбция в ултравиолетовия участък на спектъра;
  4. се държат по подобен начин при редица химични реакции.

Изхождайки от тези общи свойства, са разработени методи за определяне на протеина в биологични течности.

Методи за определяне на общия протеин

Сред методите за определяне на концентрацията на общия протеин, няколко основни групи могат да бъдат разграничени въз основа на различни принципи:

  • azotometricheskie;
  • гравиметрично (тегло);
  • "Pretsipitatsionnye";
  • спектрофотометрия;
  • рефрактометричен;
  • колориметричен.

В допълнение към изброените по-горе, са разработени и други методи, например флуорометрични, поляриметрични, както и методи за атомно-абсорбционна спектрофотометрия и аминокиселинен анализ на протеина.

Азотометрични методи

методи Azotometricheskie за определяне на общия серумен протеин са базирани на определяне на количеството на протеин азот, в резултат на разрушаването на аминокиселините, които съставят протеини. Методът беше предложен за първи път от Келдал през 1883 г. При метода на Kjeldahl, сега представлява цяло исторически интерес, азот, съдържаща се в състава на протеини се окислява до амониев йон и точното му количество се определя чрез титруване със солна киселина. Освен това, амониев йон може да бъде определена от реагент Nessler е, манометричен метод, след превръщане на амониев йон в молекулярен азот чрез действието на хипобромит, или с помощта на оптичен тест Warburg от ензим глутамат дехидрогеназа. Въз основа на факта, че протеините от биологични обекти съдържат средно от 16% азот, получен от анализа на азот, умножено с коефициент 6,25. В исторически план се използва фактор 6.25, въпреки че стойността му зависи от белтъчния състав на тестваната проба. За отделни протеинови фракции в серум или плазма стойността на фактора варира от 5.69 до 6.52.

Недостатъкът на методите за измерване на азот е продължителността и сложността на процедурата, въпреки че образуваният в реакцията амоняк може да бъде определен чрез ензимен метод. Автоматизацията позволява използването на този метод в редица случаи като метод за сравнение, поради неговата достатъчна точност и възпроизводимост.

Гравиметрични методи

Гравиметричните (тегловни) методи за определяне на общия суроватъчен протеин се основават на изсушаване на протеините до постоянно тегло и претегляне на аналитични скали. Методите са трудоемки и практически не се използват за определяне на общия суроватъчен протеин. Гравиметричният метод продължава да се използва в някои лаборатории за определяне на фибриногена в кръвната плазма.

Методи "утаяване"

Методи "Pretsipitatsionnye" за определяне на общия протеин се основават на намаляване на разтворимостта на протеините и образуването на суспензия на материала от частици под влиянието на различни средства. От съдържанието на протеин в пробата за изпитване се оценява чрез светлинен интензитет разсейване (нефелометричен метод за анализ), определена от броя на светлина разсейване частици или за намаляване на светлинен поток получената суспензия (турбидиметрично метод за анализ).

Резултатите от тази група методи зависят от различни фактори: скоростта на смесване на реагентите, температурата на реакционната смес, рН на средата, наличието на чужди съединения, методите на фотометрията. Внимателното спазване на условията на реакцията насърчава образуването на стабилна суспензия с постоянен размер на суспендираните частици и производството на възпроизводими резултати. Методите за "утаяване" за определяне на белтъка в серума не бяха разпознати и бяха намерени приложение при определяне на белтъка в урината, цереброспиналната течност и много отделни протеини, използващи специфични антитела.

Спектрофотометрични методи

Спектрофотометричните методи за определяне на общия протеин на кръвния серум се основават на измерване на абсорбцията на светлина в ултравиолетовия участък.

Протеиновите разтвори имат абсорбция при 270-290 и 200-225 nm. Абсорбцията при 270-290 nm се определя от наличието в протеиновата молекула на ароматни аминокиселини - тирозин, триптофан и фенилаланин. Абсорбцията при 200-225 nm е почти 20 пъти по-висока от тази при 280 nm и се дължи главно на пептидните връзки.

Точността и специфичността на методите за определяне на протеини въз основа на абсорбцията при 270-290 nm са малки, тъй като съдържанието на тирозин и триптофан може да варира в различните протеини на кръвния серум. В допълнение, присъствието в серума на свободни аминокиселини - тирозин и триптофан, пикочна киселина и билирубин, абсорбиращи при 280 nm, въвежда известна грешка. В тази връзка този метод не се използва за директно определяне на общото съдържание на протеини в серума.

Напротив, абсорбцията в ултравиолетовия участък - 200 - 225 nm се дължи основно на пептидни връзки и следователно абсорбцията на различни протеини в серума се различава незначително. В този спектрален диапазон се наблюдава Beer закон при концентрация на серумен протеин до 120 g / l.

Определянето на общия серумен протеин чрез директна фотометрия при 210 nm дава резултати, сравними с метода на биурет и метода Kjeldahl. В същото време този метод практически не се използва поради необходимостта от използване на кювети, които не абсорбират при 210 nm, и монохроматор, което увеличава цената на метода.

Рефрактометрични методи

Рефрактометричен методи за определяне на общия серумен протеин основава на способността на протеинови разтвори на пречупване на светлината на. При температура от 17,5 ° С индекс на пречупване вода е 1,3332 при същата температура, индексът на пречупване серум варира между 1,3480-1,3505. Поради факта, че концентрацията на електролити и непротеинови органични съединения, влияещи си рефрактивна сила е ниска и достатъчно постоянно в здрави човешки серум, стойността на индекса на пречупване на кръвен серум зависи главно на неговото съдържание на протеини. Калибрирайте инструмента със серум с известна концентрация на протеин. Простотата прави рефрактометрия удобен метод за определяне на общото съдържание на протеин в серум, въпреки че в редица заболявания, особено диабет, хронична бъбречна недостатъчност, употребата му може да доведе до значителна грешка.

Колориметрични (фотометрични) методи

Колориметричните методи за определяне на общия протеин се базират на цветни реакции на протеини с хромоген-образуващи реагенти или на неспецифично свързване на багрилото.

Сред колориметрични методи за определяне на общата концентрация на серумен протеин най-често се счита тест биурет въз основа на така наречените "реакцията цвят биурет", по време на който протеини взаимодействат в алкална среда с меден сулфат, за да се образуват съединения, оцветени в виолетов цвят, интензитет на цвета в зависимост от концентрацията на общия протеин в серума. Биоретният метод за определяне на общия протеин в серума е одобрен като унифициран през 1972 г.

Колориметричните методи за определяне на общия протеин на кръвния серум са доста прости и относително евтини. Недостатъкът на метода е намесата на някои вещества (включително наркотици).

Други методи за определяне на общия серумен протеин

Флуорометрични и други съвременни методи за определяне на общия протеин (например, polyarigrafichesky микрометод или атомноабсорбционния анализ) показват висока чувствителност и специфичност, обаче необходимостта да влезе специално оборудване и понякога специална квалификация анализатор заедно с определяне достатъчно висока стойност прави това изследване метод домейн институциите и значително ограничава употребата му в клиничната лаборатория.

Литература:

  • Наръчник "Лабораторни методи за изследване в клиниката", издаден от Меншиков VV - Москва, "Медицина", 1987
  • AV Козлов А. В., Слепъшева В. В. - Определяне на протеина в кръвния серум.
  • Медицинска биохимия: лабораторна работилница, издавана от Semikolenova NA - Omsk, издателство "Държавно университетство Омск", 2005 г.

Свързани статии

Количествени методи за определяне на общия протеин в урината

За количественото определяне на протеина, всяка проба от урина е подходяща. Повечето изследователи, за да определят големината на дневната загуба на протеини, предпочитат да определят съдържанието на протеини в урината, събрани на ден.

раздел: изследване на урината

Общ серумен протеин

Под термина общ белтък от кръвен серум се има предвид голям брой протеини, присъстващи в кръвния серум и различна структура, физикохимични свойства, функции. Всички протеини от кръвния серум се разделят на албумин и глобулини. В кръвната плазма в допълнение към албумина и глобулините също съдържа фибриноген, така че общото съдържание на протеин в кръвната плазма е малко по-високо, отколкото в серума.

раздел: Клинична биохимия

Определяне на общия протеин в серума в съответствие с биуретната реакция

Определянето на общия протеин чрез биуретна реакция е най-честият метод за определяне на общия протеин в серума. Методът е сравнително евтин, опростен и има добра възпроизводимост и специфичност, като се използва като ви дава възможност да учат и двете анализатори (автоматични и полуавтоматични) и конвенционален фотометър.

раздел: Клинична биохимия

Протеин в урината: методи за определяне

Патологичната протеинурия е един от най-важните и постоянни признаци на заболявания на бъбреците и пикочните пътища. Определянето на концентрацията на протеин в урината е задължителен и важен елемент от теста за урината.

раздел: изследване на урината

Фотометрични методи за определяне на карбамид

Фотометричните методи за определяне на уреята се основават на реакцията на карбамид с различни вещества с образуването на оцветени съединения. Сред фотометричните методи за определяне на карбамид, най-често срещаните методи се основават на реакцията на карбамид с диацетилмоноксим.

раздел: Клинична биохимия

Лекция: ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ОБЩИЯ ПРОТЕИН В КЛЕТНАТА СЕМЕСТ

Резултати от експериментите Таблица 3.

СЪДЪРЖАНИЕ НА ДОКЛАДАВЪПРОСИ ЗА ВЪЗСТАНОВЯВАНЕ

6.1. Какви нива на структурна организация на протеиновата молекула знаете? Какви връзки са свързани със стабилизацията им?

6.2. Какво представлява протеиновата денатурация? Какви нива на структурната организация са унищожени?

6.3. Какви денатуриращи агенти ви познават? Какви връзки в протеиновата молекула те основно унищожават?

6.4. Какво определя разтворимостта на протеина? Какви фактори стабилизират белтъка в разтвора?

6.5. Какво се има предвид чрез обратимо и необратимо утаяване на протеините? Кои протеинови валежи са обратими? Какви протеинови валежи са необратими?

6.6. Какво причинява необратими реакции на утаяване на протеин? Прилагането им в медицинската практика.

6.7. Дали протеинът се коагулира от разтвора в присъствието на излишък от киселина или алкален алфа? Защо?

6.8. Дали протеинът ще се утаи под въздействието на: 1) ниски концентрации на разтвор на натриев хлорид; 2) високи концентрации на разтвор на натриев хлорид; 3) ниски концентрации на разтвор на живачен хлорид?

6.9. Какво е изсолването на протеини? Каква е целта на изцеждането в медицината?

6.10. Какво определя заряда на протеиновата молекула в разтвора?

6.11. Определете изоелектричната точка на протеина. Как мога да намеря протеин IET?

6.12. Определя се посоката на движението на протеина с pI = 4,6, когато се фракционира чрез електрофореза в буферен разтвор с рН = 8,2.

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ОБЩАТА ПРОТЕИНА В КРЪВНАТА СЕМЕСТ

ЦЕЛ НА РАБОТАJOBТЕОРЕТИЧНА ЧАСТ

Съдържанието на общия протеин в кръвния серум (плазма) може да се характеризира с концепции нормо-, хипо- и хиперпротеинемия, с които се означават състояния, придружени от нормални (не превишаващи границите на физиологичните колебания), намалена или повишена концентрация. Средното общо съдържание на протеин в кръвния серум, е както следва: възрастни - 65-85 г / л при кърмачета - 46-60 г / л при деца до 2 години - 51-75 г / л, над 2 години - 60-85 грама / л.

Промени в нивото на общия протеин също могат да бъдат абсолютен, и относителен. Последните обикновено се отбелязват с увеличение (намаляване) на обема на кръвта. Така polyplasmia ( "вода" отравяне), изобилие инфузионен разтвор на глюкоза и други физиологични течности, анурия, хиперсекреция на антидиуретичен хормон алдостерон и че насърчава задържане на вода в тялото, да доведе до развитие относителна хипопротеинемия; чрез обезводняване (дехидратация) поради загуба на течности по време anacatharsis, обилно диария, холера, безвкусен диабет, изпотяване (повишена температура), полиурия открити относителна hyperproteinemia.

При по-голямата част от болестите на вътрешните органи, придружени от промени в протеиновия метаболизъм, хипопротеинемия, мечки обикновено вторично придобита характер (първична хипопротеинемия случва относително рядко и е генетично обусловена недостатък се дължи на гени, кодиращи определени серумни протеини, като например -. analbumineniya, агамаглобулинемия и др).

Абсолютна хипопротеинемия се открива при патологични състояния, при които има намаляване на биосинтезата, повишен катаболизъм или повишена загуба на протеини. Най-честите причини за това са:

1. Недостатъчна хранителния прием на протеин, обикновено се наблюдава с недохранване, глад, тумори, стесняване на хранопровода, разстройства на функцията на стомашно-чревния тракт (поради разграждане на протеин храносмилането и усвояването на хранителни съставки), когато продължително възпаление на червата. Според A.A. Покровски дори небалансиран състав на храната аминокиселина понякога може да доведе до хипопротеинемия.

2. Инхибиране proteosinteticheskoy чернодробна функция наблюдава при хепатит на паренхимни, както и отравяне, причинени от дълги гнойни процеси злокачествени заболявания действие на някои химични отрови. Засегнатите чернодробните клетки, които са на мястото на образуване на албумин, фибриноген и глобулини част, могат да се синтезират плазмени протеини в достатъчни количества, така че разработването хипопротеинемия дължи главно хипоалбуминемия и hypofibrinogenemia.

3. Увеличаване на разбивка протеин в тялото, причинени от необходимостта от компенсиране на високите енергийни разходи, свързани с недостиг на пластмасови ресурси (изгаряне болест, рак, хипертиреоидизъм, хиперкортизолизъм и т.н.).

4. загуба на телесна протеин с кръв по време на остра и хронична екскреция кървене в нефротичен синдром, чрез повредената чревната лигавица (малабсорбция) и кожата (псориазис, обширни изгаряния и т.н.).

Наблюдавано е намалено протеиново съдържание в кръвната плазма дори при определени физиологични състояния, например при жени през последните месеци на бременността и по време на кърмене.

Трябва да се отбележи, че за нормални жизнените процеси на тялото от хипопротеинемия използва предимно албумин фракция на кръвна плазма протеини. При увеличаване на разходите албумин, които определят най-вече кръв онкотично налягане разработване оток наблюдавания при патологични състояния, включващи намаляване на съдържанието на протеини в кръвната плазма е под 50 г / л. Също така е добре известно, че половината от калция на кръвната плазма се свързва с албумин. Следователно, хипоалбуминемията почти винаги се съпровожда от хипокалциемия. По този начин е налице намаление само протеин-свързан (неактивен физиологично) калциев фракция, която не води до развитието на тетания и конвулсии. Една важна функция е да свързват албумин и транспорт на билирубин, свободни мастни киселини и много лекарства (като салицилати, пеницилин, и сулфонамиди). Свързаните с албумин лекарства са физиологично и фармакологично неактивни. Значително намаляване на плазмения албумин, което води до намаляване на свързващия капацитет, може да увеличи нивото на свободните фракции от изложеното по-горе, което може да доведе до токсични ефекти при дози от конвенционалните лекарства.

Абсолютна хиперпротеинемия - сравнително рядко явление. Обикновено се причинява от увеличаване на биосинтезата на глобулини в клетъчните елементи на фагоцитната мононуклеарна система (поради тяхното инфекциозно или токсично дразнене) с продължителни хронични възпалителни процеси. Това се наблюдава по-специално при хроничен полиартрит, цироза на черния дроб и някои хронични процеси.

Значителна и персистираща albuminosis - до 120 г / л и по-горе, се определя на множествена миелома (плазмоцитом), макроглобулинемия Valdenshtrema, в резултат на плоските кости на черепа има допълнително образуване на огнища "анормални" или патологични протеини - парапротеини. Следователно, ако пациентът показва високо съдържание на общия протеин в кръвната плазма, следва да се оцени по-нататък за идентифициране на тези форми на анормални протеини.

Откриване на анормални протеини в серума (Парапротеинемия) най-често се наблюдава при патологични състояния, въз основа на генезиса на които са злокачествени новообразувания: mielomatoz, което представлява най-много случаи на злокачествени парапротеинемия; В-клетъчни лимфоми, включително хронична лимфоцитна левкемия; заболявания, свързани с нарушения на тежката верига на имуноглобулин, които включват група рядко срещащи се заболявания, характеризиращи се с натрупване в кръвната плазма или урина на определени с фрагмент на Н веригата анормална протеин. Отнася се до парапротеинемия групата и криоглобулинемия, в която кръвната плазма на пациенти за наличие на криоглобулини, които включват протеини, утаеното при охлаждане кръвно плазмени проби под температура на човешкото тяло. Понякога, особено ако концентрацията на протеин е висока, интраваскуларното утаяване може да причини кожни лезии като пурпура или феномена на Рейно.

От казаното по-горе, хипопротеинемията почти винаги се свързва с хипоалбуминемия и хиперпротеинемия с хиперглобулинемия.

При много заболявания процентът на отделните протеинови фракции често се променя, въпреки че общото количество протеин в серума остава в рамките на нормалните граници. Това състояние се нарича dysproteinemia. Например, поради относително ниско молекулно тегло, загуба на значителни количества албумин възникне при условия, които се характеризират с повишена пропускливост на биологични мембрани разделящи кръвна плазма от интерстициална течност. Ето защо, ако възпалителна реакция към увреждане, поради увеличаване на съдовата пропускливост, има "изпотяване" на албумин в интерстициална течност, което води до намаляване на плазмената концентрация - хипоалбуминемия. Въпреки това, плазмените фракция нараства бързо глобулин фракции (предимно-глобулини, които включват в състава си протеини на острата фаза реагенти или грам-глобулин), които обикновено не се променя общата концентрация на серумен протеин. В същото време се наблюдава рязка промяна в съотношението на различните протеинови фракции на кръвната плазма.

ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ПОРЪЧКАТАКоличествено определяне на общия протеин в кръвния серум, като се използва метода на биоурета

Понастоящем известни методи за количествено определяне на протеините в кръвния серум могат да бъдат разделени на колориметрични, на базата на цветни реакции на протеини с определени реагенти; спектрофотометрична, състояща се в измерване на степента на абсорбиране на светлина в ултравиолетовия регион и др. От колориметричните методи трябва да се обърне специално внимание на методите, базирани на биуретната реакция. Те са много точни, практически достъпни и се основават на способността на протеините да реагират в алкална среда с меден сулфат, образувайки комплексни съединения с виолетов цвят. В същото време разликите в интензитета на оцветяването на комплексите, образувани от албумини и глобулини, са незначителни, което позволява използването на този метод за откриване на нивото на почти всички серумни протеини.

Курс на работа

Към 0,1 ml от кръвния серум се добавят към 5 ml от работния разтвор на биурет реагента. След 30 минути при FEKe kolorimetriruyut проба в кювета с дебелина на слоя 10 mm със зелен филтър (546 нанометра дължина на вълната) в сравнение с контрола, която се получава чрез прибавяне на 5 мл биурет реагент, работен разтвор на 0,1 мл 0,9% NaCI. Изчислението се извършва съгласно калибрационната крива.

Изграждане на калибрационна крива. От 10% от стандартен протеинов разтвор в 0.9% разтвор на NaCl се приготвят стандартни работни разтвори, както е показано в Таблица 10 (0.1 ml от стандартния основен разтвор съдържа 0.01 g протеин). От всяко разреждане се вземат 0,1 ml от работния разтвор и се добавят към епруветките, съдържащи 5 ml от биуретния реагент. След 30-60 минути се измерва изчезването на стандартни проби при FEC спрямо контрола.

Средните стойности на оптичната плътност, съответстващи на различни концентрации, се прилагат на милиметрова хартия. На абсцисата се изобразяват концентрациите на стандартни протеинови разтвори и съответните стойности на оптичната плътност на ординатата ос. Чрез получените точки се прави права линия.

Данните за конструиране на калибрационна крива за количествено определяне на концентрацията на общия протеин в кръвния серум са представени в Таблица 4.

Данни за конструиране на графиката за калибриране Таблица 4